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近年来在纤维素降解丝状真菌中发现了一种新型并与传统纤维素酶具有协同作用的蛋白,其通过氧化的方式断裂纤维素链,辅助纤维素酶降解纤维素,在提高纤维素降解效率以及减少纤维素酶用量等方面均发挥了重要作用。该酶被划分为裂解多糖单加氧酶（lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO）和辅助活性酶类第九家族（auxiliary activity family 9,AA9）,近年来受到研究者的广泛关注。里氏木霉（Trichoderma reesei）,是重要的工业纤维素酶的生产者,研究发现,其胞外蛋白中鉴定出的AA9 LPMOs数量较少且含量较低。虽然有报道一些AA9 LPMOs能够协同里氏木酶纤维素酶降解纤维素,但对高效、耐热且具有良好纤维素酶协同作用的AA9 LPMOs需求仍然非常迫切。此外,通过遗传改造完善里氏木酶酶系的另一个难点是缺乏高效遗传操作系统。基于此研究现状,本论文开展三方面工作:1)基于目前已知的高效AA9 LPMOs的相关信息,寻找更加高效的新型AA9 LPMOs;2)针对鉴定出来的新型AA9 LPMOs进行蛋白质工程改造;3)构建高效的里氏木霉遗传操作系统。1两种新型AA9 LPMOs的发现及性质研究近年来,虽然有很多关于AA9 LPMOs的报道,但对具有广泛工业应用潜力的高效且耐热的AA9 LPMOs的需求仍然非常迫切。在本章中,发现了分别来自溶纤维素枝顶孢霉（Talaromyces cellulolyticus）和费希新萨托菌（Neosartorya fischeri）的两种新型AA9 LPMOs,命名为TcAA9A和NfAA9A。经鉴定,两者均特异性裂解纤维素,对半纤维素和几丁质没有活性;基于ESI-MS对磷酸膨胀纤维素的氧化产物分析,两者均属Type 3。使用2,6-二甲基苯酚（2,6-DMP）作为底物,TcAA9A与已被商业化应用的来自嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）的TaAA9A相比,表现出更高的活性,而NfAA9A的活性较弱。在糖化实验中,以微晶纤维素（Avicel）和脱木素木糖渣（delignined corncob residues,DCCR）为底物时,TcAA9A与TaAA9A相比表现出与纤维素酶更好的协同效应。此外,分别测试了含有TcAA9A或TaAA9A的里氏木霉（Trichoderma reesei）转化株（TrTcAA9A或TrTaAA9A）和出发株酶液中LPMOs的最适温度,发现出发株和TrTaAA9A胞外酶液LPMOs的最适温度为40℃,TrTcAA9A胞外酶液LPMOs的最适温度为40-45℃。进一步进行LPMOs热稳定性的研究发现,在45℃时,来自TrTcAA9A的LPMOs活性在温育48 h后仍保持超过70%,而TrTcAA9A和出发株的LPMOs活性分别为35%和31%。这些结果表明TcAA9A的最适温度高于TaAA9A,且与TaAA9A相比,TcAA9A在45℃下表现出良好的热稳定特性。因糖化过程时间较长,除了活性之外,热稳定性在AA9 LPMOs与纤维素酶的协同作用中也起到重要作用。TcAA9A的发现为改善木质纤维素降解酶系提供了新的选择,具有一定的工业应用潜力。2 AA9 LPMOs的蛋白质工程改造及探究其催化活性提高机理将TcAA9A、NfAA9A与TaAA9A的氨基酸序列进行比对发现,与TaAA9A相比,TcAA9A和NfAA9A的C端分别多了64个和120个氨基酸。而多出的C端序列不是碳水化合物结合模块（carbohydrate-binding module,CBM）,在NCBI中也并未找到同源序列。在本章中,对TcAA9A和NfAA9A的C端进行了截短,分明命名为truncated-TcAA9A和truncated-NfAA9A。经鉴定,truncated-TcAA9A和truncated-NfAA9A均属于Type 3,底物特异性与截短之前相比也没有发生变化。通过对比截短前后AA9 LPMOs的表面电荷发现,TcAA9A和truncated-TcAA9A之间的表面电荷没有明显差异;然而,truncated-NfAA9A的催化位点附近的正电荷与NfAA9A的相同位点相比,有了显著增强。通过糖化实验发现,TcAA9A与来自里氏木霉的纤维素酶的协同作用在截短后没有变化,但truncated-NfAA9A与来自里氏木霉的纤维素酶的协同作用与NfAA9A相比,有了显著增强。因此,推测活性位点附近的正电荷强弱对AA9 LPMOs的活性存在显著影响。这一点也通过truncated-NfAA9A活性位点附近氨基酸的点突变实验得到了证实。这些结果说明增强AA9 LPMOs活性位点附近的正电荷,能提高其活性。以上发现与之前AA9 LPMOs理性改造的策略完全不同,这为AA9 LPMOs的蛋白质工程改造提供了新的线索。3里氏木霉高效遗传操作系统的构建有限的筛选标记限制了里氏木霉的多基因操作,因此建立一套可循环利用筛选标记或者没有筛选标记的遗传操作平台尤为重要。在本章中,首先尝试将Cre-loxP系统引入里氏木霉中,并利用Tet-on系统控制Cre重组酶的表达。但实验结果证明,Tet-on系统不适用于里氏木霉。而后,尝试在里氏木霉中构建成簇的规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）-Cpf1/Cas9系统,但实验结果证明未进行密码子优化的cpf1可能无法在里氏木霉中表达,以及原生质体转化的方式可能会在一定程度上破坏单导RNA（single guide RNA,sgRNA）或Cas9或两者形成的复合物结构,导致Cas9切割DNA的活性无法发挥。虽然最终没有在里氏木霉中成功建立起可循环利用筛选标记或者没有筛选标记的遗传操作系统,但这些尝试为下一步成功构建高效的遗传操作系统奠定了基础。