研究背景和目的前列腺癌（prostate cancer,PCa）是全球男性人群中发病率高居第二的癌症。近年来,我国的前列腺癌发病率也呈逐年上升趋势。前列腺癌在初期常常采用雄激素阻断治疗,但是往往在治疗2-5年后会转变成激素非依赖性前列腺癌。激素非依赖性前列腺癌对低剂量的化疗药物或放射疗法的细胞毒性作用均不敏感,而高剂量的放化疗又会给患者带来极大的副作用。因此,寻求新型的无毒、高效的抗肿瘤药物,诱导前列腺癌细胞死亡仍具有重要意义。中医药是我国传统文化的瑰宝,有着悠久的历史,为中华民族的健康繁衍做出了巨大贡献。大量的临床研究证实,有些中药不仅有抑制肿瘤的增殖和转移、预防并发症、提高生活质量和减少治疗副作用等多方面重要作用,而且具有毒性小的特性。目前,中药抗肿瘤作用的研究主要集中在筛选中药有效成分,阐述其对肿瘤相关基因和蛋白等生物分子的调控作用。前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PS A）是前列腺癌重要的肿瘤标志物,既用于前列腺癌的早期诊断和临床分期,还可用于疗效观察及随访。多种中药活性成分被证实,可通过阻断前列腺癌细胞中雄激素受体的基因表达来下调雄激素依赖性和雄激素非依赖性通路中的PSA基因和蛋白的表达,从而抑制前列腺癌的发生发展。此外,microRNA（miRNA）是一类内源性的非蛋白编码小RNA,其表达谱因肿瘤类型、分期和疗效呈差异性,是前列腺癌诊断、分型和疗效观察的潜在肿瘤标志物。通过对以上标志物的检测,既可以满足临床早期诊断和疗效观察的需求,也可以作为药物作用机制研究的手段辅助新药开发和药物筛选。因此建立有关肿瘤标志物的检测技术用于中药有效成分的筛选显得意义重大。上世纪二十年代,人们开始运用现代科学的研究方法进行中药作用机制的研究。近年来,大量多学科配合和交叉的创新性技术被应用于中药实验研究中,发挥开拓中医药视野和推动中医药发展的作用。生物传感技术就是其中重要的一支生力军。生物传感技术作为由生命科学和信息科学交叉发展起来的新型技术,具有高灵敏度、高精度、高通量、实时监测、快速检测、结构小巧、经济使用的优势。基于生物传感技术建立的生物传感器由生物分子感应单元和信号传导器组成,感应单元可以选择性识别待测物,形成复合物,产生的理化效应转变成与待测物浓度成比例的电信号,从而检测待测物的量。纳米材料是指基本单元的尺寸小于100 nm的材料,其具有一些特殊的物理和化学性质,如比表面积大、表面能高、超顺磁性等。由于以上显著优势,各种新型纳米材料不断被应用于生物传感器的感应单元,以提高生物传感平台的检测性能。其中荧光生物传感器以其操作简单、灵敏快捷、良好的生物相容性等优势,引起了研究者的广泛关注。本研究拟采用氧化石墨烯和聚多巴胺磁纳米颗粒建立纳米荧光生物传感平台,分别用于检测前列腺癌肿瘤标志物PSA和miRNA,并将其应用于前列腺癌细胞的miRNA检测,监控中药调控miRNA的表达,为中药有效成分的作用机制和筛选研究提供理论基础和新型技术手段。方法与结果本课题的主要内容包括以下三个部分:第一部分:基于HCR信号放大策略的荧光纳米生物传感器检测PSA构建基于GelRed和PSA核酸适配体共同作用形成荧光供体,氧化石墨烯（GO）为荧光受体的荧光能量共振转移（FRET）生物传感器,结合杂交链式反应（HCR）放大检测信号用于前列腺特异性抗原的检测。首先,合成具有茎环结构的纳米核酸适配体探针,其序列主要由两个部分组成:一部分为可特异性结合PSA的识别序列,另一部分则是发夹结构的杂交链式反应（HCR）的触发序列。将待测物加入反应体系混合,进行荧光测定:若待测物中含有PSA时,适配体探针识别序列与之结合,同时发夹结构被打开,触发序列暴露,从而触发杂交链式反应,形成超长的双链DNA产物。GelRed作为荧光核酸染料,与HCR反应形成的超长双链DNA产物结合,产生强烈的荧光信号。氧化石墨烯（GO）对双链DNA链亲和力较弱,因此荧光猝灭作用弱,溶液依然具有强烈的荧光信号。而没有PSA的体系中,HCR不能被触发,发夹链末端的单链DNA被氧化石墨烯吸附,发生荧光能量共振转移导致荧光猝灭,因此溶液呈现较弱荧光信号。有靶标PSA的体系,荧光信号强;没有靶标PSA的体系,荧光信号弱。然后,从pH、GO浓度、HCR反应时间和温度四个方面进行条件优化,确定体系最优的检测条件为pH 7.4,15 μg/ml GO,HCR反应时间60分钟,HCR反应温度37℃。在优化条件下,对不同浓度PSA进行荧光强度测定,发现在100 pg/mL-200 ng/mL范围内,PSA浓度的对数与体系荧光信号呈线性关系,检测限低至10 pg/mL。此外,我们考察了生物传感器的选择性,分别将CD63,BSA,CEA,AFP,HCG,D-D二聚体和随机ssDNA加入反应体系后检测,其产生的荧光信号强度相比PSA的荧光信号均很弱,说明了该生物传感器对PSA有很高的选择性。最后,我们在10%各种体液（人血清、唾液、尿液）标本中添加PSA,检测到的荧光信号与空白对照有显著性差异,表明该平台对生物样本的适用性。第二部分:基于双链特异性核酸酶信号放大策略的荧光纳米生物传感器检测miRNA构建基于双链特异性核酸酶（DSN）放大和磁吸减少内滤光效应（IFE）的聚多巴胺磁纳米颗粒（MNPs@PDA）的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器用于miRNA-141的检测。首先,在碱性缓冲液中,加入盐酸多巴胺和磁纳米颗粒避光混悬制备聚多巴胺包裹的磁纳米颗粒,并采用拉曼光谱仪、红外光谱仪、透射电镜对MNPs@PDA进行表征。将表征良好的MNPs@PDA超声分散于水中备用。在无靶标miRNA存在的情况下,荧光素标记的DNA探针因π-π堆积作用吸附在MNPs@PDA表面,发生FRET导致荧光猝灭。在靶miRNA存在的情况下,标记探针与miRNA互补杂交形成DNA-RNA杂合双链。这种构象改变后,便从MNPs@PDA表面发生解吸附。由于DSN可以选择性地消化DNA-RNA杂交链中的DNA,所以荧光素标记的探针被酶切成短小的片段,同时靶miRNA被释放出来。荧光素标记的探针碎片因为长度短,与MNPs@PDA亲和力弱,于是荧光信号恢复。而释放的靶miRNA再次与下一个DNA标记探针杂交,上述过程循环发生,从而导致荧光信号成几何级数放大。此外,由于IFE的存在,分散在溶液中的猝灭剂会降低荧光强度。因此,MNPs@PDA分散在溶液中会减弱荧光信号。我们将MNPs@PDA通过磁力吸引到比色皿的底部,从而使这部分减弱的荧光得以恢复,进一步增大了荧光信号。单位时间内,靶miRNA越多,酶切产生的探针片段越多,荧光信号越强,证实了实验可定量测定低丰度的靶miRNA。然后,从MNPs@PDA浓度、DSN酶的工作温度、DSN酶的浓度、酶反应时间四个方面进行条件优化,确定最优的体系检测条件为10 μg/ml的MNPs@PDA、温度50℃、DSN浓度0.2 U/mL,反应时间90分钟。在优化条件下,对不同浓度miRNA-141进行荧光强度测定,发现在5 pmol/L～5 nmol/L范围内,miRNA-141浓度的对数与体系荧光信号呈线性关系,检测限低至0.42 pmol/L,而且比不加磁吸的3.8 pmol/L检出限,低了一个数量级。此外,我们考察了生物传感器的选择性,将非互补核酸序列miR-21、RS ssDNA、SM RNA与miRNA-141分别加入反应体系进行检测,能成功区分出靶标miRNA-141,说明了该生物传感器的选择性好。最后,我们将该传感器直接检测前列腺癌细胞株PC-3细胞和正常前列腺上皮细胞株RWPE-1细胞中提取的总RNA,发现癌细胞来源的miRNA-141表达上调,表明该平台对生物样本的适用性。第三部分:荧光纳米传感器监测中药活性成分调控前列腺癌相关miRNA的研究在第二章的工作基础上,选取四种中药活性成分,分别为姜黄素、人参皂甙Rh2、槲皮素、和厚朴酚,作用于前列腺癌PC-3细胞株,采用基于DSN信号放大策略的纳米荧光生物传感器,高灵敏的监测肿瘤细胞与中药抗癌活性成分作用前后miR-141表达的变化。首先,采用CCK-8法和流式细胞技术分别测定了不同浓度的四种中药活性成分对前列腺癌PC-3细胞株的生长影响。结果表明,姜黄素、人参皂甙Rh2、槲皮素、和厚朴酚对前列腺癌细胞的增殖具有抑制作用,呈剂量-时间依赖性,诱导凋亡作用呈剂量依赖性。并采用Western blotting检测中药作用后PC-3细胞的凋亡相关蛋白表达,均呈现促凋亡蛋白表达增加,抗凋亡蛋白表达减少。表明这四种中药活性成分具有抗前列腺癌作用,可以抑制癌细胞增殖,诱导癌细胞凋亡。然后,将四种中药活性成分分别与PC-3细胞孵育体外培养,使用试剂盒分别提取药物不同浓度作用组和空白对照组细胞的总RNA,并运用纳米荧光传感器分别检测与各组细胞提取物。结果显示,与对照组相比,人参皂甙Rh2和槲皮素各浓度组的荧光信号差异不显著;而姜黄素与和厚朴酚组的荧光信号显著增强,且随浓度增加而增强,说明姜黄素与和厚朴酚以浓度依赖性方式促进miR-141表达。同时,这一系列结果也通过RT-qPCR得到了进一步的佐证。以上结果表明,这四种中药活性成分均对癌细胞有明显的抑制作用,细胞株存活率降低、凋亡率升高;姜黄素与和厚朴酚均可上调前列腺癌细胞miR-141的表达。结论1.构建了基于杂交链式反应的氧化石墨烯荧光生物传感器用于高灵敏、高特异性的PSA检测。2.构建了基于双链特异性核酸酶信号放大策略的荧光生物传感器用于高灵敏、高特异性地检测miRNA。3.运用荧光平台评估前列腺癌细胞在药物作用前后miR-141的表达,为药物作用靶点机制探讨和药物筛选提供了研究基础和技术手段。