微生物是医院获得性感染的主要因素,医院环境的生物污染可以引起一系列传染病的爆发流行。近几年的研究表明,一些气载病原微生物能够通过空气传播造成传染病的流行。过去对医院环境微生物气溶胶的传播主要是通过培养皿的自然沉降法检测细菌浓度的变化以及细菌耐药性及某些致病菌含量等方面来确认的。然而,未能证明医院病房环境、门诊房间内外环境分离的微生物气溶胶的起源及其同源性,未能用国际上通用的ANDERSEN-6采样器等来测定气溶胶微生物的含量等。因此,本课题测量了ICU病房、门诊注射室空气环境(5个医院的ICU病房环境及楼道、门诊注射室3个房间及走廊和大厅)的气载需氧菌的含量,在此基础上,(1)统计ICU病房环境、门诊注射室环境气载大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的含量;(2)对从ICU病房环境分离的87株气载大肠杆菌的耐药性及其ESBLs耐药基因的进行了检测;(3)采用分子生物学方法(ERIC-PCR)对ICU病房和门诊注射室空气环境中不同地点分离到的共131株大肠杆菌(其中病房87株、门诊44株)的遗传相似性进行聚类图的比较;(4)采用血清学分型方法,进一步对从门诊注射室环境、ICU病房环境及周围空气环境中分离的131株大肠杆菌同时进行了4组致病性因子的鉴定;(5)结合RFLP、PFGE、流式细胞仪技术(flow cytometer, FCM )对大肠杆菌的耐药性、耐药异质性进行了检测。通过膜联蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)和PI(propidium iodide)的双染色,做了细菌凋亡(apoptosis)的研究探讨。根据以上研究结果,评估了医院环境微生物气溶胶的危害性及其向环境中的传播。1 ICU病房、门诊注射室环境气载需氧菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的含量本试验采用ANDERSEN-6级空气微生物样品收集器和RCS离心式采样器在5个医院的ICU病房环境及距病房环境5m、10m的走廊和大厅,一个医院门诊注射室环境的3个房间及其公共走廊和大厅的不同距离收集气溶胶微生物,一方面,通过对医院环境中气载需氧菌含量、气载大肠杆菌含量、气载金黄色葡萄球菌含量的检测,以及它们在ANDERSEN六级采样器上的分布规律来推断其对病人及医务工作人员自身可能造成的危害,从而使人们对医院空气环境中产生的微生物气溶胶及其健康威胁的高度重视。研究结果表明,5个病房环境内总的需氧菌含量和可吸入的需氧菌含量平均分别为126.8和70.38 CFU/m3空气。可吸入的需氧菌与需氧菌总的含量之比在47.9～70.2%之间,并且在5个病房环境内所检测的结果并没有很大差异(p>0.05)。5个ICU病房环境内总的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌含量分别为63和96 CFU/m3空气;可吸入的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌含量分别为43和81 CFU/m3。而且,每一个ICU病房环境内气载大肠杆菌和气载金黄色葡萄球菌的含量差异极显著(p<0.01)。在5个病房环境内可吸入的金黄色葡萄球菌含量占总的金黄色葡萄球菌含量的比例在59.8～79.2%之间,而且它们之间并没有显著差异(p>0.05)。门诊注射室环境气载需氧菌和大肠杆菌在五个采样点(Room A、B、C、Corridor、Hall)的浓度分别是211和18 CFU/m3;206和18 CFU/m3;304和13 CFU/m3;567和22 CFU/m3;651和18 CFU/m3。走廊和大厅中需氧菌和可吸入的需氧菌浓度明显高于房间内的(p<0.05)。气载需氧菌中主要以葡萄球菌属和埃希氏菌属为主,其中革兰氏阴性菌占需氧菌总数40.08%～46.98%。2 ERIC-PCR对医院空气环境中气载大肠杆菌向室外环境传播的鉴定本课题测定了5个ICU病房和1个注射室及其公共走廊和大厅不同距离的空气环境中大肠杆菌含量,在细菌学鉴定的基础上,采用ERIC-PCR方法对不同地点分离到的大肠杆菌鉴定其同源性,获得大肠杆菌ERIC片段指纹图谱,通过该片段在细菌基因组内的数量和分布之间的关系,比较其遗传相似性,确定医院环境内微生物气溶胶向环境中的传播。ERIC-PCR结果表明,从ICU病房环境中分离到的大肠杆菌与距病房环境不同距离楼道内(5m和10m)分离到的40株大肠杆菌相似性可达100%,22株大肠杆菌的相似性在90%以上;从注射室环境三个房间、公共走廊和大厅内分离到的大肠杆菌10株相似性可达100%,18株大肠杆菌相似性在90%以上。由此,可得出结论,ICU病房环境内和楼道内的分离到的大肠杆菌极有可能来源于病房环境内的同一菌株,注射室环境内,公共走廊和大厅内分离到的大肠杆菌也可能来源于同株大肠杆菌。说明源于医院环境内微生物气溶胶能够通过气体交换和人员的流动向周围环境传播,通过气象条件和人员流动传播到不同的距离,造成周围环境的空气污染,引起医院环境的获得性交叉感染。3医院空气环境中大肠杆菌的血清学分型采用血清学分型的方法进一步对从门诊注射室和ICU病房及周围空气环境中分离的共131株大肠杆菌同时进行了4组致病性因子的血清学鉴定,一方面,可以验证各种引起婴幼儿腹泻的致病性大肠杆菌,是否通过医院环境中空气的传播,造成医院环境交叉感染;另一方面,为研究分离的131株大肠杆菌是否存在O111、O55、O26、O119、O127、O157:H7和O128等血清群已被确认为引起世界上许多国家婴儿腹泻爆发的致病因子。研究结果表明,通过血清学凝集试验, EPEC阳性的有27株,共有7种血清型,其中优势血清型O142:K86(B) 12株、3株O26:60(B6)、3株O127a:K63(B8)、3株O44:K74(L)、3株O114:K90(B)、2株O125:K70(B15)、1株O111:K58(B4); ETEC阳性有10株,有3种血清型,其中6株O25:K19(L)、2株O8:K40(A)K47、2株O78:K80; EIEC凝集的有9株,共有2种血清型,其中O112ac:K66有5株、4株O124:K72;未检到O157:H7。4医院ICU病房环境中大肠杆菌耐药性的检测及其超广谱β-内酰胺酶耐药基因的鉴定通过对医院ICU病房环境及楼道空气中分离的87株大肠杆菌耐药性的调查、分析,进一步证明了医院环境中的大肠杆菌可以通过室内外气体的交换而相互传播,可能对周围环境及其周边病人、医务工作人员的健康构成潜在的威胁。同时还对87株医源性大肠杆菌的产超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectyumβ-Lactamase,ESBLs)耐药基因(TEM、SHV、CTX-M)做了筛查。结果表明,大肠杆菌对青霉素类药物、加酶抑制剂的抗生素和碳青烯酶类抗生素、对第一、二、三、四代头孢类抗生素、单环类抗生素、氨基糖甙类抗生素、喹诺酮类药物有不同程度的耐药性。其中对青霉素类药物耐药率最高,对加酶抑制剂的抗生素和碳青烯酶类抗生素的敏感率最高。通过与ERIC-PCR的同源性比较,其同源性在100%的菌株其耐药菌谱也相同,进一步证明了医院环境中的气载大肠杆菌可通过空气传播,造成医源性的交叉感染。87株大肠杆菌的ESBLs耐药基因谱以TEM基因为主。药敏试验结果还显示,大肠杆菌耐药率高,多重耐药菌株多,耐药菌谱宽,且与我们在取样时了解到的医院环境的日常药物使用情况相吻合,说明耐药性的产生可能是由于治疗过程中用药情况复杂,种类繁多,而且用药不合理,以及与大肠杆菌的耐药机制有关。5流式细胞仪检测大肠杆菌的耐药性及细菌的凋亡采用流式细胞仪技术对分离的E.coli和25922标准菌株进行了氨苄西林和头孢噻肟的药物敏感试验;还通过PI(propidium iodide)和AnnexinⅤ双荧光染色技术,对E.coli的细菌凋亡进行了试验分析;另外结合RFLP、PFGE、流式细胞仪技术(flow cytometer, FCM )对E.coli进行了的检测。研究结果表明,与抗生素共孵育后,PI染色E.coli的DNA,可以很准确的计算出其MIC值,从而可确认E.coli的药物敏感结果;与抗生素共孵育后可以在DNA直方图上正常二倍体细胞的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰(sub-G1峰,即AP峰,Apoptotic peak),峰的面积代表凋亡细胞中的DNA含量。根据此亚二倍体峰面积,可以计算出凋亡细胞在总细胞数中的所占的百分比。利用PI和AnnexinⅤ的双染色,使用流式细胞仪检测能够可以区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞;结合RFLP、PFGE、流式细胞仪技术(FCM )不仅对大肠杆菌的耐药性、耐药异质性进行了快速、高灵敏的检测,还可以建立E.coli的指纹图谱、发现新菌株新亚型,这将对微生物领域的研究开辟新的技术平台。