自从益生菌在食品工业中应用以来,它的安全性问题就一直受人们关注。尤其是当今,随着越来越多食品安全问题的出现,人们对食品安全也有了更深的认识。各国科学家也对食品中益生菌的添加更加关注,投入的研究也在逐渐增多。而在益生菌的安全性研究中,益生菌基础性的研究则至关重要,只有如此,才能从根本上确保所添加食品的安全性。本研究以三种主要的益生乳酸菌乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌实验室保存菌株及其酸奶分离株为研究对象,就其生化分型及鉴定、16SrRNA基因PCR扩增及序列分析、耐药情况、PFGE分型及对Hela细胞的体外粘附等方面做了较为全面的研究,以期为我国食品用益生乳酸菌的安全性溯源、监测和分析等提供可靠的理论依据,同时综合所有研究结果建立一个益生乳酸菌菌种数据库,以便更好地保证益生乳酸菌在食品中使用的安全性。一、用API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定了实验室保存菌株:55株乳酸杆菌、46株双歧杆菌、10株嗜热链球菌,及分离株:57株乳酸杆菌、10株双歧杆菌、42株嗜热链球菌,并对其生化谱进行聚类分析。结果显示:生化鉴定保存菌株鉴定结果与厂家所给菌名不完全相符。分离株生化鉴定结果与包装袋标示菌名也不完全相符。样品中双歧杆菌的检出率较低。各菌株分型结果显示生化谱相同或相似的菌被分为一类,乳酸杆菌、双歧杆菌保存菌株由于种类多生化谱较为复杂,其余则比较单一。生化分型可能无法进行准确分型。二、设计不同菌种的引物,采用16SrRNA基因PCR扩增及序列分析方法,对乳酸杆菌、双歧杆菌及嗜热链球菌进行了鉴定和分型。结果显示:乳酸杆菌、双歧杆菌保存菌株16SrRNA鉴定结果与API50CHL鉴定结果不完全相符。分离株两种方法鉴定结果完全一致。嗜热链球菌所有菌株两种方法鉴定结果完全一致。总的来看,几种菌的种引物特异性均较好,可用于种的鉴定。该鉴定方法可大大节约实验成本。16SrRNA基因序列分型效果不理想。三、采用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)方法,对乳酸杆菌、双歧杆菌及嗜热链球菌实验室保存菌株及酸奶分离株进行了分子分型及分析,结果显示:确定了乳酸杆菌属的主要限制性内切酶为AscI及SmaI,双歧杆菌属的主要限制性内切酶为XbaI,嗜热链球菌的主要限制性内切酶为SmaI,初步建立了三种菌种水平PFGE分型鉴定方法。根据进化树图谱分析了保存菌株与酸奶分离株的同源性关系。PFGE分子分型方法可以在基因水平很好地对益生乳酸菌进行分型,可成为判定其他鉴定方法鉴定益生乳酸菌是否准确的一个判别标准。几种鉴定方法相比而言,API50CHL生化鉴定结果可能会出现不该有的误差。16SrRNA基因PCR扩增方法鉴定结果相对稳定,而且基本可以准确地鉴定菌株到种水平,PFGE型别的分析则可以证实鉴定结果的准确性。四、采用CLSI手册推荐的肉汤微量稀释法对乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌实验室保存菌株及酸奶分离株进行了耐药性检测和分析。结果显示:乳酸杆菌保存菌株对16种抗生素均表现出较强的耐药性,大部分菌株为多重耐药株,分离株耐药性略低,但大部分菌株也表现出多重耐药性。保存菌株耐药范围更广。双歧杆菌保存菌株大部分对2-3种抗生素耐药,少数几株对3种以上抗生素耐药;10株分离株中3株表现为多重耐药。保存菌株耐药范围更广。嗜热链球菌10株保存菌株2株没有耐药性,其余耐1-6种抗生素;分离株大部分耐2-3种抗生素。保存菌株与分离株耐药范围无明显差别。三种菌相比,乳酸杆菌耐药性最强,嗜热链球菌次之,最后是双歧杆菌。五、采用体外粘附实验,选取子宫颈癌细胞Hela细胞为体外细胞模型,以乳酸杆菌、双歧杆菌及嗜热链球菌为有益菌,鼠伤寒沙门氏菌AMCC50333为病原菌,对这几种菌对Hela细胞的粘附作用以及对鼠伤寒沙门氏菌粘附Hela细胞的影响进行了分析,结果显示:乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌的保存菌株与分离株均对Hela细胞表现出粘附特性,但差异不明显。同属内不同种的粘附性不同。三种菌保存菌株与分离株均对鼠伤寒沙门氏菌粘附Hela细胞有显著的抑制作用。但三种菌的抑制性没有明显差别。被鉴定为乳酸乳球菌的菌株对Hela细胞的粘附性较强,对鼠伤寒沙门氏菌粘附Hela细胞的抑制作用也较强。综合所有分型方法来看,PFGE分子分型方法是最佳的分型方法,其次为16SrRNA序列分型、生化分型。通过一系列的实验,建立了我国食品工业中常用益生乳酸菌菌种数据库。