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植物蛋白的特异性糖苷修饰一直被怀疑具有潜在的免疫原性,进入人体后可能具有安全性风险,因而限制了它的进一步应用。但这些数据均来自于叶片而不是种子,对种子蛋白的糖苷类型的研究非常有限,而关于其免疫原性的报道则基本没有。水稻胚乳是一种经济有效的生物反应器,因此,研究种子和叶片的糖苷类型差异以及植物特异性糖苷的免疫原性,对水稻胚乳细胞生物反应器的应用具有重要意义。在本研究中,为了探讨水稻胚乳细胞蛋白的糖苷修饰与叶片蛋白修饰间的差异以及植物特异性糖苷的免疫原性,我们首先获得了水稻胚乳特异性表达的人α-1,6-岩藻糖转移酶(FUT8)基因和β-1,4-半乳糖转移酶(GalT)基因水稻品系。为了加快育种进程,我们优化了一种利用水稻基因RBE4作为内参的定量PCR法,用于快速准确地筛选纯合子单株和鉴定转基因的拷贝数。通过杂交,把FUT8、GalT和hAAT(人α抗胰蛋白酶)这三个基因聚合起来,获得了部分人源化糖苷修饰的AAT转基因水稻品系,然后比较了不同糖苷修饰的AAT的糖基化结构,并对其免疫原性做出评价。主要研究结果如下:1.通过MALDI-TOF MS分析,我们发现水稻叶片和种子蛋白的糖苷修饰存在很大差异。种子糖蛋白中同时含有α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖的结构占总糖苷的4.8-14.5%,而叶片中为27.9-44.2%;但是种子中仅含有β-1,2-木糖(不含α-1,3-岩藻糖)的结构有61.1-80.2%,而叶片中只有35.1-50.9%。2.我们将两个引入人类特异性N-连接糖苷修饰的α-1,6-岩藻糖转移酶基因和β-1,4-半乳糖转移酶基因——FUT8和GalT利用胚乳特异性启动子Glb转入水稻基因组中。通过MALDI-TOF MS分析,转基因水稻的储藏蛋白谷蛋白中可检测到6.8%的α-1,6-岩藻糖和1.9%的β-1,4-半乳糖。3.我们发现内源储藏蛋白谷蛋白和重组蛋白OsrAAT的糖苷结构都比较单一。但是谷蛋白中最主要的结构是MMX,而OsrAAT中最主要的结构是MXF,这两种结构几乎都占据了各自全部N-连接糖苷的50%。4.我们将FUT8、GalT和hAAT这三个基因聚合后发现,部分人源化AAT(mgOsrAAT)中含有38.4%的α-1,6-岩藻糖,并且α-1,3-岩藻糖的含量由植物源AAT(OsrAAT)中的 82.5%下降至 mgOsrAAT 中的 22.7%。5.我们在动物体内检验了 OsrAAT、mgOsrAAT和hAAT的免疫原性,结果发现这三者之间IgG、IgM和IgE滴度没有明显区别。6,豚鼠皮肤被动过敏反应(PCA)显示,植物特异性糖苷具有较弱的免疫原性,进一步分析显示其免疫原性主要来自α-1,3-岩藻糖而不是β-1,2-木糖。7.我们通过检测α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖特异性抗体的抗体浓度,发现这三种蛋白免疫的兔血清间的抗体主要由α-1,3-岩藻糖产生。文献检索发现α-1,3-岩藻糖并不是植物特异性糖苷,因而推断植物蛋白的α-1,3-岩藻糖修饰并不会产生任何安全风险。8.在本研究中,我们优化了一种利用水稻内源基因RBE4作为内参基因,检测效率和准确性都很高的鉴定纯合子和拷贝数的方法。该方法鉴定的纯合子在单插入位点的准确性达到100%,双插入位点的准确性达到92.3%。通过本研究,我们发现植物糖苷的免疫原性较弱,且其免疫原性主要是由α-1,3-岩藻糖产生,而非β-1,2-木糖。鉴于临床应用的AAT中同样含有α-1,3-岩藻糖,我们推测植物糖苷对人体是安全的。