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O-甲基化反应被运用于化合物的甲基化修饰、芳香醚的生产与羧基基团的保护等,在化合物的合成中具有广泛的应用。由于化工生产中使用的传统甲基化试剂存在高毒性、低选择性等不足,需要开发绿色温和的替代型生产工艺。O--甲基转移酶作为特异性催化O-甲基化反应的生物催化剂,具有反应条件温和、选择性高等优点,在化工生产中有着巨大的应用潜力。除此之外,O-甲基转移酶还是褪黑素、辅酶Q10等天然产物生物合成途径中的限速酶,其活性制约了目标产物生物合成效率。因此,对O-甲基转移酶的研究具有重要的理论意义和应用价值。本文通过基因挖掘构建O-甲基转移酶库,结合多底物筛选的方法,获得了具有广底物谱的O-甲基转移酶AtCOMT(Arabidopsis thaliana Caffeic acid O-methyltransferase);并通过理性设计对 AtCOMT进行了 分子改造,提高了其催化褪黑素生物合成途径限速步骤(N-乙酰-5-羟色胺O-甲基化生成褪黑素)的活性,并在此基础上通过酶催化动力学分析与分子动力学模拟对活性提高的机理进行了探讨。本文具体实验内容和结果如下:(1)通过基因挖掘的方法筛选出不同来源与功能的O-甲基转移酶,通过分子克隆技术在大肠杆菌中进行异源表达,成功克隆了 16个O-甲基转移酶,建立了 O-甲基转移酶库;(2)针对多个具有研究价值且底物易得的O-甲基化反应,建立了相应的检测方法(HPLC、GC),用于筛选合适的O-甲基转移酶。通过多底物的筛选,最终从O-甲基转移库中获得具有广底物谱的AtCOMT;(3)鉴于AtCOMT能够催化N-乙酰-5-羟色胺(NAS)的O-甲基化反应,而此反应已被明确报道为褪黑素异源生物合成途径中的关键限速步骤,以NAS为底物对AtCOMT进行了理性改造。通过对AtCOMT进行同源建模,结合分子对接获得酶-底物复合物的构象,并据此制定理性设计策略,增强酶的活性口袋对底物NAS的结合能力,最终获得三点组合突变体 C296F-Q310L-V314T,活性提高 8.5 倍;(4)通过对野生型AtCOMT与优势突变体的酶催化动力学分析和分子动力学模拟,发现突变体对NAS的亲和性与催化效率都有所提高;296位和310位突变氨基酸与NAS之间的作用力增强;314位突变氨基酸与前两个点突变存在协同作用,并影响了局部的蛋白结构,促进了 310位突变氨基酸与底物之间的结合。综合得出突变体通过增强与NAS的结合作用从而提高酶活性的结论。