背景细胞的死亡分为凋亡(apoptosis)和非凋亡,非凋亡包括坏死、自噬(autophagy)等。凋亡被称之为细胞程序性死亡,它是调节机体正常发育的重要机制,涉及一系列调控因子。这些调控因子在维持细胞自稳中发挥重要作用。肿瘤的发生,发展与治疗也受到多凋亡调控因子的调控。凋亡细胞死亡的特点是染色体浓集,核DNA降解和片段化,染色体边缘化,形成凋亡小体及半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族活化。肿瘤的治疗包括手术、放疗、化学药物治疗等。化学药物治疗是治疗肿瘤的主要手段之一,通常是通过诱导细胞凋亡来清除肿瘤细胞。经过多年的研究,已经认识到细胞凋亡被抑制是促使肿瘤形成同时也是肿瘤化疗耐受的重要原因。因此,通过其他的方式诱导细胞死亡已经成为有潜力的新的抗肿瘤机制。有研究表明,抗癌药物可以通过诱导自吞噬细胞死亡发挥作用。因此,诱导肿瘤自噬性死亡有着重要的临床治疗价值。自噬是一种细胞内降解机制,除了参与胞内蛋白和细胞器的质与量控制外,也被认为是一种与凋亡、坏死并列的程序性细胞死亡机制。自吞噬细胞死亡的特点是双层或多层膜的胞质囊泡包裹大量细胞质,线粒体及内质网等细胞器的出现。熊果酸(Ursolic acid,UA)是源自于多种药用植物的叶子,花及果实的五环三萜类化合物,它具有抗肿瘤、抗糖尿病、降脂、抗炎、抗氧化等多种生物学效应。实验目的本实验旨在探讨熊果酸对HPV-16 E6/E7阳性TC-1癌细胞的增殖抑制和诱导TC-1癌细胞自噬性死亡。方法利用细胞培养,熊果酸实验浓度为0,1μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,作用时间分别为熊果酸作用1、2、3、4、5天,采用MTT法检测熊果酸对TC-1细胞增殖抑制效应;在普通光镜下和PI染色后荧光显微镜下观察细胞的形态变化;体内用荷瘤小鼠观察熊果酸的抑瘤效果;DNA梯带方法检测是否有凋亡征象;通过流式细胞术Annexin V-FITC/PI染色法观察不同浓度熊果酸在48小时内对细胞早期凋亡的影响;用Western Bloting检测凋亡相关蛋白Caspase-3表达变化;透射电镜检测细胞自噬;Western Bloting检测自噬体膜标志性蛋白LC3的表达变化。结果光镜下观察和MTT实验结果提示熊果酸对TC-1细胞有显著增殖抑制作用,并呈时间、剂量依赖;体内试验用药组移植瘤生长慢,大剂量组(50mg/kg)瘤重明显低于对照组,抑瘤率达69%;DNA片段检测无典型凋亡“梯带”出现;流式细胞术检测也未发现典型凋亡特点;Western bloting凋亡相关蛋白Caspase-3表达无改变;电镜观察到处理组TC-1细胞有大量自噬体;自噬体标志蛋白LC3由LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ转化,提示UA可诱导TC-1细胞自噬死亡。结论1.熊果酸对TC-1瘤细胞有明显增殖抑制并促进细胞死亡作用。2.熊果酸体内体外均显示出显著的抑制肿瘤作用。3.熊果酸通过非凋亡途径诱导细胞死亡。4.熊果酸诱导TC-1细胞自噬死亡。5.熊果酸通过诱导TC-1癌细胞自吞噬作用的新发现,提供了肿瘤新治疗途径的可能。