1研究背景与研究目的横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)是儿童软组织肉瘤最常见的一个类型,肿瘤起源于能分化为横纹肌的间充质细胞,占小儿恶性肿瘤的3%-4%,占小儿软组织肉瘤的55%-60%。且发病率呈逐年上升趋势。RMS瘤体生长迅速,一般无特异性的临床表现,没有完整的真性包膜,容易形成局部浸润或经血流、淋巴管转移,基于瘤体上述的特性,此肿瘤发现时多处于临床II期以上,甚至有远处的扩散或转移,且术后复发率高,瘤体不易根治性切除,即使广泛切除后,其复发率仍可高达39%。目前,横纹肌肉瘤的早期诊断方法仍以彩色多普勒超声、CT和MRI为主,切除程度的判断及复发瘤的检测仍缺乏特异性的方法,RMS早期根治性手术切除配合术后放化疗等综合治疗,效果及预后基本令人满意,但进入III期或IV期之后,RMS的生存率明显降低,且复发率高。基于RMS的早期诊断、早期治疗的重要性,临床急需一个敏感度高、准确性强的诊断和监测的方法。进入21世纪以来,蛋白质组学已经成为肿瘤研究的热点,为肿瘤的早诊断、早治疗提供很多新的方向,特别是不断有新的、特异性强的肿瘤蛋白标记物被鉴定出,大大提高了肿瘤诊断和治疗水平。本课题组曾与中国科学院生物物理研究所、浙江大学肿瘤研究所联合应用蛋白质组学的相关技术成功的筛选并鉴定出多个恶性肿瘤的血清特异性蛋白质标记物,如肾母细胞瘤、胃癌、乳腺癌等,本课题组针对肾母细胞瘤做了系列研究,并取得一定研究成果。本实验研究以课题组前期肾母细胞瘤筛选、鉴定及验证技术路线为支撑,通过对横纹肌肉瘤组及正常健康儿童组血清进行检测及对比,筛选出特异性的蛋白质标记物,对不同分期患儿进行详细分组,再次验证并统计分析,初步建立分期诊断模型,结合随访及手术结果,将筛选出的蛋白质标记物应用于复发瘤的预测及手术切除程度的判断,最后通过定量分析并与临床常用检查方法对比,明确其临床应用的敏感性及特异性。2材料与方法2.1实验材料2.1.1临床病例资料本课题研究选取的血清样本385例均来自河南省郑州大学第一附属医院,采集时间2008年1月至2013年12月。分为:正常组、肿瘤组(I期,II期,III期,IV期)、复发组、瘢痕形成组、姑息性切除组、根治性切除组。该实验横纹肌肉瘤患儿病理诊断结果均为:胚胎性横纹肌肉瘤(ERMS),所有病理样本均经穿刺活检或手术切除后取得,均送我院病理科按照统一的流程进行检查,所有病理诊断结果均得到我院两位以上的病理学专家的验证。抽血取样条件:晨起6点,所有横纹肌肉瘤患儿及健康儿童均在空腹状态下抽血,留取外周静脉血5ml,室温静置1小时,后转至离心机处理,在4℃低温环境下离心20分钟,转速:3000r/min,离心力:3000×g,抽取标本的上清液,以每管100ul进行分装,分装完毕后放入低温冰箱储存,冰箱温度条件:-80℃。本实验均得到受试者监护人的知情同意,并通过伦理委员会的批准。2.1.2主要试剂及仪器主要试剂:尿素(Urea)、DTT(DL-Dithiothreitol,1,4-二硫代苏糖醇)、IAM(Iodoacetamide,碘乙酰胺)、CHAPS(3-环乙胺-1-丙磺酸)、SPA(sinapic acid,芥子酸)、TFA(Trifluoro-Acetic Acid,三氟乙酸)、超纯水(HPLC grade)和乙腈(Acetonitrile,CAN)购自Sigma公司,产地:美国;Spectra Multicolor Low Range Protein Ladder购自Thermo公司,产地:美国;Trypsin购自Promega公司,产地:美国;Profiling Kit 100 MB-WCX购自Bruker Inc公司,产地:德国。主要仪器:Protein Chip、WCX2 Protein Chip、PBS II+SELDI-TOF-MS和Bio-processor购自Ciphergen Biosystems公司,产地:美国;MALDI-TOF-MS购自Bruker公司,产地:德国;High performance liquid chromatography购自Shimadzu公司,产地:日本;2D-LC-LTQ-MS购自Thermo Electron公司,产地:美国;ZUCIPDAS来自浙江大学,产地:中国。2.2实验方法2.2.1小儿横纹肌肉瘤血清蛋白质标记物的筛选及临床应用的构建已经留取的血清样本在冰浴中解冻30分钟至60分钟,完成解冻后使用4℃低温离心机进行离心5分钟,离心力为:12000×g,离心出来的上清液留取备用。5μL血清样本、10μL MB-WCX Magnetic Beads、10μL MB-WCX Binding Buffer依次加入Eppendorf管中,充分振荡,植入磁珠分离器中,后加入MB-WCX Wash Buffer 100μL,MB-WCX Elution Buffer 5μL加入装有磁珠的Eppendorf管中,反复吹打,MB-WCX Stabilization Bu ffer 5μL加入待测管中,再次吹打,备用。芯片的预处理。添加稀释液U9(1%DTT、9mol/L尿素、2%CHAPS),混合并摇匀,加入弱阳离子交换芯片的孔中,96个样本可以通过弱阳离子交换芯片WCX2 Protein Chip一次性得到检测,WCX2 Protein Chip插入Bio-processor工作支架中,仔细记录芯片的坐标情况。导入SELDI-TOF-MS仪器中进行检测,对差异性血清蛋白质进行筛选。整理并导出SELDI-TOF-MS实验检测数据,去除无效数据,分子质量与相对表达量的标准要统一,完整提取各个样本中蛋白质分子质量和相对表达量准确数据。SELDI-TOF-MS提取的数据经过ZUCIPDAS技术分析(浙江大学),排除并严格处理技术上的干扰,挑选出m/z差异小于0.3%的数据,并将其归为一类。Wilcoxon秩和检验对初筛的数据进行进一步分析处理,得到不同组别的处理数据,找出差异性蛋白质,通过SVM筛选处理,得到youden指数最高的组合模型,得出小儿横纹肌肉瘤特异性血清蛋白质标记物。统计学分析不同分期血清样本的蛋白质标记物,得出相应的表达强度数据,同时进行生存分析,绘制ROX曲线,通过曲线下面积的计算,再经过SVM筛选处理,得到youden指数最高的组合模型并得到分期诊断的临界值。将复发组、瘢痕残留组、不同手术切除程度组患儿血清样本中差异性表达的蛋白质标记物进行统计学分析,得出不同组别患儿蛋白质标记物的表达强度,同时进行生存分析,得到复发瘤表达强度的临界值。2.2.2小儿横纹肌肉瘤血清蛋白质标记物的纯化与鉴定选取目标蛋白质表达量较高的肿瘤组血清样本,根据SELDI-TOF-MS筛选结果,应用HPLC分离纯化目标蛋白质样品。解冻冰箱取出的血清。600μl ACN和300μl超纯水加入100μl血清样本中,吹打、离心,SPD SpeedVac真空冷却离心浓缩系统将上清液冻干,高效液相色谱仪中冲洗C18色谱柱分离纯化上述血清样品,EP管收集对应于HPLC图上峰值中的蛋白质,使用MALDI-TOF-MS对蛋白质样品进行质荷比的检测,找出质荷比与7636Da相近的的蛋白质所在的样本(大约存在0.03%的误差)。酶解目标蛋白质。应用2D-LC-LTQ-MS系统进行检测。应用SEQUEST程序检索目标蛋白质标记物,导入Bioworks数据库,检索出与目标肽段匹配的蛋白质。2.2.3小儿横纹肌肉瘤血清蛋白质标记物的验证及敏感性、特异性对比ELISA方法对目标蛋白质(MIF)进行定量分析。配备MIF冻干标准品,浓度每2倍递增。加样器校准后,取100μl各浓度样本,吸头垂直滴加入96孔板,抗MIF抗体提前预包被,同时设置3个复孔。每组各取10个血清样本,取100μl各浓度样本,吸头垂直滴加入96孔板,板块整个用封板模封闭,温箱控制严格按照说明书,酶标板孵育。各孔液体吸去后,抗人MIF抗体用生物素标记,取100μl加入孔内,再次酶标板孵育;孔板用自来水和清洗剂注满,玻璃板、电泳槽及相关附件予以清洗,在吸水纸上拍干孔内的液体,后使用通风橱,自然状态下晾干。孔板各孔充分晾干后加入ABC工作液,酶标板孵育;超纯水再次洗板,自然状态下晾干,90μl TMB显色液加入每孔中,酶标板孵育后各加入100μl TMB终止液。ELISA方法对目标蛋白质(MIF)进行定量分析的结果与临床常用诊断方法进行对比,以病理学检查结果作为判断的金标准,以验证MIF诊断模型的敏感性及特异性。3结果3.1小儿横纹肌肉瘤血清蛋白标记物的筛选标准化处理并分析肿瘤组和正常组质谱数据,提取蛋白质表达的峰值数据及蛋白质分解的肽段峰值数据信息。Wilcoxon秩和检验对蛋白质峰值数据进行处理(P<0.01),通过数据分析及统计,得到蛋白质各自表达的m/z及其峰值;对比两种数据并进行t检验(α=0.01),针对上述两组数据进行统计分析得出:横纹肌肉瘤患儿血清高表达的蛋白质峰值有6个,横纹肌肉瘤患儿血清低表达的蛋白质峰值有1个,导入SVM程序进行数据处理,得到youden指数最高的组合模型,得出m/z 7636Da的目标蛋白标记物。该标记物在正常组中低表达,表达强度为298.30±216.36;在肿瘤组中高表达,表达强度为2108.40±897.83。两组进行比较差异有统计学意义,P<0.01。3.2小儿横纹肌肉瘤血清蛋白质标记物M/Z 7636Da对肿瘤分期的判断应用上述筛选技术对RMS不同分期M/Z 7636Da的表达强度进行对比分析,结果提示:RMS-I期组、RMS–II期组、RMS-III期组和RMS-IV期组中的m/z7636Da蛋白质的表达强度分别为923.95±361.88、1854.75±322.97、2567.95±412.15、3086.96±414.47。同时对正常组、RMS-I期组、RMS–II期组、RMS-III期组和RMS-IV期组分别进行统计学分析,任意两组数据之间差异均有统计学差异,P<0.01。M/Z 7636Da表达水平生存分析统计结果示:正常组,M/Z 7636Da表达量<423.5000;RMS-I期组,423.5000<M/Z 7636Da表达量<1424.0000;RMS–II期组,1424.0000<M/Z 7636Da表达量<2311.5000;RMS-III期组,2311.5000<M/Z 7636Da表达量<2819.0000;RMS-IV期组,M/Z 7636Da表达量>2819.0000。3.3小儿横纹肌肉瘤血清蛋白质标记物M/Z 7636Da对复发瘤预测及判断对m/z 7636Da蛋白质标记物在正常组、术前组、复发组、术后瘢痕形成组中的差异进行对比分析,表达强度如下:正常组为298.30±216.36、术前组为1875.00±962.61、复发组为2209.35±786.17、瘢痕形成组为440.35±401.19。m/z 7636Da蛋白标记物在术后复发组的表达与术前组对比,差异无统计学意义(P>0.05),与正常组对比差异有统计学意义(P<0.01);m/z 7636Da蛋白标记物在术后瘢痕形成组的表达与正常组对比,差异无统计学意义(P>0.05),与术前组对比差异有统计学意义(P<0.01)。术后M/Z 7636Da表达水平生存分析统计结果示:M/Z 7636Da表达量>1135.0000提示术后复发。3.4小儿横纹肌肉瘤血清蛋白质标记物M/Z 7636Da对微创手术切除程度判断对m/z 7636Da蛋白质标记物在不同微创手术切除程度组中的差异进行对比分析,表达强度如下:正常组为298.30±216.36、术前组为1875.00±962.61、姑息性切除组为1756.70±695.01、根治性切除组为476.70±324.75;m/z7636Da蛋白标记物在姑息性切除组的表达与术前组对比,差异无统计学意义(P>0.05),与正常组对比差异有统计学意义(P<0.01);m/z 7636Da蛋白标记物在根治性切除组的表达与正常组对比,差异无统计学意义(P>0.05),与术前组对比差异有统计学意义(P<0.01)。3.5小儿横纹肌肉瘤血清标记物的纯化及鉴定应用HPLC分离纯化样本中目标蛋白质,EP管收集对应于HPLC图上峰值中的蛋白质,进行MALDI-TOF-MS检测,找出质荷比为7636Da蛋白质或肽段样品。酶解质荷比为7636Da的蛋白质或肽段,置入2D-LC-LTQ-MS系统检测,获得PMFs,进一步检测分析获得酶解蛋白质片段氨基酸序列,导入SEQUEST程序中,应用Bioworks数据库检索,匹配并获得完整的氨基酸序列图,结果提示质荷比为7636Da的蛋白质或肽段其序列为:RASVPDGFLSELTQQLAQATGKPPQYIAVHVVPDQLMAFGGSSEPCALC SLHSIGKIGGAQNRSYSKLLCGLL;此肽段为MIF(Macrophage migration inhibitory factor)。3.6小儿横纹肌肉瘤血清蛋白质标记物的验证本阶段实验用ELISA方法检测小儿横纹肌肉瘤不同分期MIF的含量,经过统计及数据分析,结果提示随着分期的上升,MIF的含量依次升高,正常组、I期、II期、III期、IV期中MIF的表达量分别为692.18±221.43、1018.27±246.54、1293.73±225.22、2381.82±408.19、2790.09±321.12,各分期与正常组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。本阶段实验应用ELISA方法对正常组、术前组、姑息性手术切除组、根治性手术切除组MIF的表达量进行定量分析,表达量分别为692.18±221.43、2133.79±809.22、2833.91±769.41、1499.09±588.76,姑息性手术切除组与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01),根治性手术切除组与术前组比较差异有统计学意义(P<0.01)。本阶段实验应用ELISA方法对正常组、术前组、复发组、术后瘢痕形成组MIF的表达量进行定量分析,表达量分别为692.18±221.43、2133.79±809.22、2740.46±415.09、1284.18±348.34,复发组与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01),术后瘢痕形成组与术前组比较差异有统计学意义(P<0.01)。3.7小儿横纹肌肉瘤血清蛋白质标记物的敏感性、特异性验证本阶段实验以ELISA方法对样本进行MIF定量分析,以该结果为临床诊断模型,与临床常用的辅助检查手段进行对比,如:64层CT平扫+增强、3.0MRI,以病理学检查结果作为判断的金标准,以验证MIF诊断模型的敏感性及特异性,该部分实验对象均为盲选患儿,与正常健康儿童比较,MIF诊断模型的敏感性为97.9%,特异性100%,与常见小儿腹部实体肿瘤比较,MIF诊断模型的敏感性为97.9%,特异性87.5%。4结论4.1.目标蛋白质m/z 7636Da可以作为小儿横纹肌肉瘤的特异性血清生物学标记物,对临床怀疑横纹肌肉瘤,可以对该蛋白质标记物进行检测。4.2.目标蛋白质m/z 7636Da可以作为小儿横纹肌肉瘤的分期诊断的血清生物学标记物,对复发瘤的预警及手术切除程度的判断有重要的指导意义。4.3.通过对目标蛋白质或肽段的统计分析及鉴定,质荷比为7636Da的蛋白质或肽段初步确定为MIF。4.4.MIF在小儿横纹肌肉瘤早期诊断的敏感性较其它常用影像学诊断方法具有明显的优势。4.5.MIF在小儿横纹肌肉瘤与常见小儿腹部实体肿瘤鉴别的特异性较好,提示MIF可能还存在于其他小儿实体肿瘤中。后期研究中,须进一步扩大样本量,与其他肿瘤进行对比,以明确其特异性,及在不同类型RMS的表达情况。同时,进一步探索MIF与RMS发生发展的相互关系,从而明确MIF在RMS发病机制中的关键作用。