创伤、感染、肿瘤、先天性疾病等原因所致的骨缺损临床常见。作为治疗骨缺损金标准的自体骨移植,由于存在取骨量有限和取骨区并发症,已不能满足骨缺损治疗的需要。组织工程学的兴起为治疗骨缺损带来了新的希望。骨组织工程利用具有成骨能力或潜能的种子细胞与生物材料在体外复合后植入体内,通过新生的骨组织修复骨缺损,是理想的治疗模式。组织工程有三大要素,即种子细胞、诱导因子和支架。其中种子细胞是其中最基本也是首要的环节。干细胞有自我复制及多向分化潜能,是组织工程最理想的种子细胞。目前干细胞的来源主要有骨骼肌卫星细胞、胚胎干细胞、骨髓来源的间充质干细胞等。骨骼肌卫星细胞含量较低,所需肌肉取材较难；胚胎来源的干细胞存在免疫排斥及伦理问题；骨髓间充质干细胞作为组织工程骨的种子细胞已被多数学者认可,以往骨组织工程种子细胞的研究多集中于骨髓间充质干细胞,但其存在数量少、取材困难、体外培养相对困难且易老化、病人不易接受等缺点。自从2001年Zuk等从人体抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中第一次分离获得具有多向分化潜能的干细胞,即脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)以来,脂肪干细胞的研究成为继骨髓干细胞之后又一热点。研究表明ADSCs体外特定诱导条件下实现了向骨、软骨、脂肪、肌肉、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞以及肝细胞方向分化。ADSCs以其自体来源、容易获取、细胞充足、多向分化、基因稳定表达、自体移植无免疫排斥反应、不涉及医学伦理学问题等特点可能成是构建组织工程化骨组织较理想的种子细胞。诱导因子在是组织工程的三要素之一,目前骨组织工程诱导因子来源主要是三种途径：直接加入诱导因子、通过载体缓释诱导因子和基因治疗技术使靶细胞自身表达释放诱导因子等方面。前两者是单纯给予的外源性诱导因子,但组织工程研究中,细胞因子无论是从天然生物中提纯,还是用基因工程表达,均存在程序复杂,产量低,活性不稳定等缺点,因此如何有效发挥细胞生长因子适时、适量效用,利用细胞与基质材料特异性勃附,细胞增殖,定向分化,发挥正常的生理功能,以实现最终理想的功能替代,一直是组织工程研究的难点与热点,基因工程技术与组织工程的结合为以上问题的解决提供了可供选择的良好办法。基因技术在组织工程中的应用主要是将目标诱导因子的基因转染到种子细胞里使诱导因子持续释放,以满足种子细胞定向诱导分化的需要。诱导因子是干细胞定向分化的决定性影响因子,骨形态发生蛋白(bone morp-hogenetic protein, BMP)是转化生长β超家族成员,目前已发现共有20多种亚型,BMP-2是特异性的骨生长因子,是目前已知能单独诱导干细胞成骨分化的诱导因子,也是公认活性最强的成骨诱导诱导因子之一。其基因重组产品rBMP-2是唯一获美国食品药物管理局批准可用于临床的成骨诱导因子。但这种外源性诱导因子rBMP-2具有诸多弊端,如易扩散、降解快、半衰期较短、用量大、价格昂贵等,极大地影响其成骨效应的发挥,限制了其在临床上的广泛应用。利用基因转染技术通过BMP-2基因修饰种子细胞,使其内源性地表达,从而克服上述缺点,可望解决骨组织工程的难题之一—诱导因子问题基因转染技术的应用涉及到一个关键的问题是如何选择合适的基因转染载体。目前常用的转基因载体包括病毒载体和非病毒转基因载体两大类。其中病毒载体在目前的科研工作和临床试验中是主要使用的载体。但是病毒载体具有一些难以克服的缺陷,如制备复杂、靶向特异性差、高免疫原性、体内不能重复使用、可能导致感染的潜在危险和引起细胞恶性转化等,上述这些缺陷,限制了以病毒载体在临床上的实际应用。所以近年来有越来越多的研究者将视线放在了非病毒载体上面。非病毒载体具有成本低、制备相对简单、容易批量生产、携带遗传物质容量大、安全性好等优点,但也有转基因效率相对低下、本身并无特异细胞或组织靶向性等缺点。聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI)是一种新的多聚阳离子型的基因载体,作为一种转基因效率相对较高的非病毒载体,已经成为非病毒载体领域衡量其他类型载体效率的一个“金标准”。本课题以PEI为基因转染载体,ADSCs作为种子细胞,将诱导因子BMP-2基因转染到靶细胞ADSCs中,使其持续分泌诱导因子BMP-2,进而诱导种子向成骨细胞分化,为进一步构建组织工程骨,治疗骨缺损、骨不连等疾病奠定理论基础和实验依据。本课题分三部分进行。第一部分为兔脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)的基本生物学特性及其多向诱导分化的实验研究。对ADSCs进行体外分离培养及传代扩增,探讨兔ADSCs理想的体外培养方法；观察其原代及传代细胞的形态及生长特点,探讨ADSCs生物学特性；对其表型特征进行鉴定,以及体外传代培养和成骨分化诱导对其表型的影响。探讨体外传代培养对ADSCs增殖分化及凋亡的影响。对第3、6代ADSCs行成脂、成骨诱导分化,评价ADSCs多向分化潜能,进一步确认其干细胞的属性,并探讨ADSCs体外定向诱导成骨分化潜能,为ADSCs作为骨组织工程种子细胞提供理论依据。第二部分为PEI介导基因转染兔ADSCs的实验研究。观察PEI (13KDa,高分枝)对兔ADSCs的毒性大小,观察PEI不同浓度、不同时间点下ADSCs存活率,对PEI作为ADSCs基因载体的安全性进行评价；观察PEI微粒、PEI和DNA混合物微粒的微观形态,评估PEI与DNA质粒的相容性,并探讨PEI与DNA质粒结合的最佳N/P比值(即PEI所含氨基氮与DNA所含磷酸基团的摩尔数比)；检测PEI介导增强绿色荧光蛋白(pEGFP)基因转染ADSCs的转染效率,观察不同N/P比值对转染率的影响,探讨获得最高转染的最佳N/P比值；从而评估PEI作为基因载体转染ADSCs的可行性及效率,为ADSCs基因转染寻找较为理想的基因转染载体,为下一步ADSCs成骨研究提供理论依据。第三部分为PEI介导BMP-2基因转染兔脂肪干细胞的实验研究。BMP-2是公认的最强的也是唯一单独诱导干细胞成骨分化的细胞因子。构建真核表达质粒pEGFP-N1-BMP-2,以PEI为基因载体介导BMP-2基因转染ADSCs,检测转染后基因表达,分析PEI介导BMP-2基因转染ADSCs的可行性、转染的稳定表达、转染效率以及转染对ADSCs生物学特性的影响,评估PEI为基因载体介导BMP-2基因转染ADSCs的成骨分化效果,为了进一步研究非病毒载体PEI介导的BMP-2转染ADSCs在动物体内成骨修复的作用,从而探讨利用基因技术在骨组织工程种子细胞自身表达细胞因子BMP-2诱导下兔脂肪干细胞成骨分化的效果,为进一步构建组织工程骨,治疗骨缺损、骨不连等疾病奠定理论基础和实验依据。第一部分兔脂肪干细胞的基本生物学特性及其多向诱导分化的实验研究目的：探讨脂肪干细胞的分离培养方法及其基本生物学特性,并对细胞表型进行鉴定,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法：从成年日本大耳白兔的颈背部分离脂肪组织,通过I型胶原酶消化法获取原代ADSCs并培养,待细胞生长至约80%融合时传代,用倒置显微镜逐日观察细胞生长情况和形态特征,研究其增殖过程,描绘其生长曲线；流式细胞技术检测细胞表面标记物CD29、CD34、CD44、CD45的表达及其变化,分析其表型特征；将ADSCs行成骨和成脂诱导,分别通过ALP、茜素红、VonKossa(钙结节)染色和油红。染色检测ADSCs成骨分化潜能和成脂分化潜能,未诱导组作为对照组。结果：体外培养的脂肪干细胞呈梭形纤维样细胞形态,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈“S”型。流式细胞仪检测第3、6代ADSCs均高表达CD29、CD44,阳性率超过90%；低表达CD34、CD45阳性率不超过5%,且CD29、CD44随着传代表达逐渐增高,CD34、CD45随细胞培养时间延长表达逐渐降低。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、vonKossa染色阳性,成脂诱导实验组油红。染色阳性,对照组均为阴性。结论：兔脂肪干细胞在体外易于分离培养,保持稳定增殖,并表达间充质干细胞相关的表型,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。有望成为骨组织工程理想的种子细胞。第二部分聚乙烯亚胺介导基因转染兔脂肪干细胞的实验研究目的：探讨非病毒载体聚乙烯亚胺(PEI,13KDa,分支型)作为载体介导基因转染脂肪干细胞的可行性。方法：检测不同浓度下PEI对脂肪干细胞的毒性。以PEI为载体,不同N/P值下将增强绿色荧光蛋白基因转染脂肪干细胞,荧光显微镜下观察转染后48h小时转染效果,计算各N/P值下的转染效率,并以Iipofectamine2000转染作为对照组。结果：当PEI浓度在50μ g/ml以内,其对脂肪干细胞的毒性极小,细胞存活率90%以上,浓度100μ g/ml以上时,PEI细胞毒性明显增加；不同的N/P值转染效率不同,当N/P<6,比值增大转染效率随之增高；当N/P值为6时转染效率最高,此后转染效率随比值的升高而下降。结论：PEI是一种低价、安全、实用、高效率的基因转染载体,可用于脂肪干细胞基因转染。第三部分聚乙烯亚胺介导骨形态发生蛋白2基因转染兔脂肪干细胞的实验研究目的：分析聚乙烯亚胺作为载体介导骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因转染脂肪干细胞(ADSCs)的基因表达,评估转染后细胞的成骨分化效果。方法：取成年日本大耳白兔的颈部脂肪,经体外分离培养的方法获得ADSCs,并对其进行表型鉴定,明确其脂肪干细胞的属性,用聚乙烯亚胺介导BMP-2基因转染至脂肪干细胞,G-418筛选获得阳性细胞克隆。RT-PCR检测mRNA表达,ELISA法BMP-2蛋白表达分泌,western-bloting法检测骨钙素和Ⅰ胶原蛋白的含量,碱性磷酸酶定量检测,并行茜素红染色,未转染组作对照。结果：从兔脂肪组织中分离出来的第3、6代ADSCs均高表达CD29、CD44,阳性率超过90%；低表达CD34、CD45阳性率不超过5%,且CD29、CD44随着传代表达逐渐增高,CD34.CD45随细胞培养时间延长表达逐渐降低；转染细胞有BMP-2mRNA的转录及其蛋白的表达分泌,碱性磷酸酶、骨钙素和Ⅰ胶原蛋白的含量增加,茜素红染色呈阳性反应,对照组阴性。结论聚乙烯亚胺可介导BMP-2基因转染兔脂肪干细,BMP-2基因在ADSCs中有效表达并诱导其定向成骨分化。