论文部分内容阅读
目的：研究非诺贝特体内、外抑制三阴性乳腺癌生长的作用及其机制。方法：采用细胞计数试剂盒-8法(Cell count kit-8,CCK-8)检测细胞生长能力,倒置显微镜观察细胞形态变化,流式细胞仪检测凋亡细胞比例和细胞周期分布比例,免疫印迹法检测相关通路蛋白水平,全基因表达谱芯片技术检测差异表达的特征基因功能类和通路变化。MDA-MB-231移植瘤小鼠模型验证体内抑制移植瘤生长能力,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(Terminal deox-ytransferase-catalyzed DNA nick-end labeling,TUNEL)检测瘤体组织切片中细胞凋亡的情况,裸鼠眼球采血,检测血常规及肝肾功能指标。结果：1.非诺贝特能够抑制乳腺癌细胞株的生长能力,其中对非诺贝特最为敏感的前五个细胞株均为三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC）细胞株：MDA-MB-231、MDA-MB-453、BT549、MDA-MB-436和MDA-MB-231-LU（指具有肺转移潜力的细胞亚系),它们的半数抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50)分别为(16.07±4.44)μML(26.72±10.04)μM,(34.47±13.88)μM,(74.46±17.75) μM和(82.09±21.21)μM,并呈现剂量依赖性,倒置显微镜下观察发现MDA-MB-231经非诺贝特处理24小时后细胞形态明显改变,活细胞数明显减少。2.非诺贝特能够诱导MDA-MB-231细胞凋亡,呈时间剂量依赖性。流式细胞仪检测结果显示,MDA-MB-231细胞经非诺贝特处理24小时后,PE Annexin V和7-AAD双阳性的细胞比例0μM剂量组对100μM剂量组为4.8%对26.0%,上升了21.2%；非诺贝特处理48小时后,PE Annexin V和7-AAD双阳性的细胞比例0μM剂量组对100μM剂量组为5.8%对48.0%,上升了42.2%；不同时间点相比,48小时100μM剂量组的凋亡细胞比例对24小时100μM剂量组为48%对26%,增高了22%,其他剂量点也有不同比例的上升,并伴有Bad蛋白上调,Bcl-xl、Survivin下调,激活caspase-3。3.非诺贝特能够诱导MDA-MB-231细胞系出现G1期细胞周期阻滞。MDA-MB-231细胞经非诺贝特处理24小时后,0μ.M和50μM剂量组的G1期细胞所占比例分别为49.2%对61.3%；非诺贝特处理36小时后,0μM和50μM剂量组的分别为47.9%对61.5%,呈现剂量依赖性,并伴随Cyclin D1、Cdk4蛋白水平的下调,p21、p27/Kip1蛋白水平的上调。4.过氧化物酶增殖物激活受体-α(Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha, PPAR-a)特异性抑制剂GW6471并不能逆转非诺贝特抑制MDA-MB-231细胞生长和诱导细胞凋亡的作用。在MDA-MB-231细胞生长方面,非诺贝特各浓度组(0、12.5、25、50和100μM)的72小时生存率对非诺贝特各浓度组(0、12.5、25、50和100μM)联合5μMGW6471的72小时生存率分别为(100±9.14)%对(99.90±9.23)%、(55.7-5.43)%对(58.664.10)%、(48.7-5.16)%对(41.43±3.66)%、(34.974±2.82)%对(28.9±2.94)%、(31.694±3.43)%对(25.71±2.84)%,各组p值均大于0.05,无统计学差异；在DA-MB-231细胞凋亡方面,单用50μM非诺贝特处理24小时和50gM非诺贝特联合5μGW6471处理24小时的凋亡细胞比例分别为(21.55±2.47)%和(20.154±1.34)%,p>0.05,两组间无统计学差异。5.非诺贝特的抗肿瘤作用可能主要与NF-κB信号通路激活相关,另外,Aktl和Erkl/2信号通路的抑制也参与其抗肿瘤作用。免疫印迹结果显示,MDA-MNB-231细胞经非诺贝特处理48小时后,NF-κB信号通路被激活,利用NF-κB通路的特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)能够逆转非诺贝特诱导细胞凋亡的作用,单用50μM非诺贝特处理24小时后凋亡细胞比例达到(20.45±±0.92)%,而50μM非诺贝特联合10nM PDTC处理24小时后凋亡细胞比例降至(6.5±±0.85)%,p<0.004,两组间有统计学差异。6.全基因表达谱芯片结果显示,在基因本体(Gene ontology, GO)的生物过程变化最显著的十个分类中,七个分类与细胞死亡相关,四个分类与细胞凋亡相关,下调最明显的十条通路中,与细胞周期相关的通路排名第一,与肿瘤相关的通路排名第四。7.非诺贝特能够抑制MDA-MB-231移植瘤小鼠模型中的移植瘤生长,诱导移植瘤细胞凋亡。连续灌胃给药32天后,非诺贝特治疗组瘤体大小对对照组为(1786.76±384.39)mm3对(2788.35±759.88)mm3,p<0.001,具有统计学差异,抑制率达35.92%；TUNEL法检测结果显示,非诺贝特治疗组的凋亡细胞比例对对照组的凋亡细胞比例为(36.22±±0.94)%对(17.844±6.60)%,p<0.0001,具有统计学差异；在安全性评价方面,对照组和非诺贝特治疗组在白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)以及血尿素氮(BUN)指标上未见明显统计学差异(p>0.05),显示出良好的安全性。结论：体外细胞株实验以及体内移植瘤小鼠模型实验均显示非诺贝特对TNBC细胞具有明显的抗肿瘤作用,其作用机制是PPAR-a非依赖性的,可能主要通过激活NF-κB信号通路以及抑制Aktl或Erkl/2信号通路,进而诱导细胞凋亡和／或周期阻滞,发挥抗肿瘤作用。非诺贝特发挥抗肿瘤作用的有效浓度体内容易实现,且具有良好的安全性。