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背景:口腔癌是口腔黏膜发生的最常见的恶性肿瘤,其特点是浸润性广、进程快、预后较差,5年存活率只有50%~55%。肿瘤的进展是由上皮和间质的相互作用,构成的肿瘤与宿主界面微环境决定的。癌相关成纤维细胞(CAFs)占肿瘤微生态环境的主要部分,它能够促使口腔癌的侵袭和转移,但其来源仍存在争论。有研究表明肿瘤细胞的调控使成纤维细胞被激活成为CAFs,但作用机制不明。近年来研究表明,肿瘤细胞可分泌外泌体,其中含有大量可促进其生长、侵袭和转移的蛋白质、RNA和脂质,细胞通过释放外泌体影响受体细胞的状态和功能。关于胰腺癌的相关研究,结果表明,胰腺癌细胞分泌的外泌体可以将癌细胞中的miR-155传递给成纤维细胞,诱导其活化为CAFs。但对于口腔癌细胞来源外泌体(Cal27-exo)在成纤维细胞活化中发挥的作用尚未见报道。目的:本研究通过将Cal27-exo与正常口腔黏膜成纤维细胞(NOMFs)共培养,检测NOMFs对Cal27-exo的摄取情况,并测定与Cal27-exo共培养后NOMFs(NOMFs+Cal27-exo)的增殖和迁移能力以及相关蛋白的表达。探讨Cal27-exo对NOMFs的诱导、活化,以及对NOMFs生物学行为的影响。初步探索NOMFs+Cal27-exo在口腔癌侵袭和转移中的调节作用。方法:1.采用组织块酶消化法原代培养NOMFs,并通过透射电镜和免疫荧光染色鉴定细胞来源;2.采用超速离心法提取Cal27-exo,并用蛋白免疫印迹、透射电镜以及粒径检测对外泌体进行鉴定;3.用PKH67标记Cal27-exo,并与NOMFs共培养,鉴定NOMFs对Cal27-exo的摄取情况;4.采用CCK8法检测NOMFs+Cal27-exo的增殖活性情况;5.采用划痕实验分析NOMFs+Cal27-exo迁移能力;6.qRT-PCR检测NOMFs+Cal27-exo相关蛋白的表达。结果:1.组织块酶消化法成功获得NOMFs,倒置显微镜观察:细胞呈扁平长梭形,大小均匀,单核,核椭圆形,位于胞质中央。排列有一定的方向,单层细胞生长,存在接触抑制。透射电镜显示:NOMFs核大且为椭圆形,无明显的凹陷,仅部分核膜为锯齿状,胞浆内细胞器较发达,富含粗面内质网、核糖体、高尔基体,可以见到散在微丝。免疫荧光染色鉴定:抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性。2.超速离心法成功提取Cal27-exo,蛋白免疫印迹示Cal27-exo高表达阳性标记蛋白Alix,CD63和TSG101。透射电镜下Cal27-exo呈直径在70-120mm之间的类圆形双层膜性囊泡。纳米粒径分析显示Cal27-exo粒径在30-150nm之间。3.PKH67将Cal27-exo标记为绿色Cal27-exo与NOMFs共培养后,成功进入NOMFs内。4.CCK8结果显示与NOMFs相比,分别共培养24h、48h、72h、96h后NOMFs+Cal27-exo的增殖活性明显增强(P<0.05),且呈时间依赖性。5.划痕实验结果示:与NOMFs相比,共培养后的NOMFs+Cal27-exo在划痕后12h的迁移能力无明显改变(P>0.05),但在18h、24h、36h、48h其迁移能力增强(P<0.05),直至划痕愈合。6.qRT-PCR结果显示:与NOMFs相比,NOMFs+Cal27-exo中PDGFR-α、VEGF和Tn-C三种蛋白的mRNA表达增加(P<0.05),α-SMA的mRNA表达减低(P<0.05),TGF-β的mRNA表达增加(P>0.05),FAP的mRNA表达减低(P>0.05),表明与Cal27-exo共培养后NOMFs被活化。结论:组织块法可成功培养出口腔黏膜成纤维细胞;Cal27能分泌丰富的外泌体,并且通过超速离心法有效分离;共培养后NOMFs+Cal27-exo的增殖活性和迁移能力明显增强,且相关蛋白的mRNA表达增加,Cal27-exo可以活化NOMFs,提示可能对于肿瘤的侵袭转移有潜在意义。