背景和目的众所周知，攻克肿瘤是生命科学领域的一个世界性难题，尤其是恶性肿瘤，严重威胁人类的生命健康。其中，肺癌的死亡率居世界恶性肿瘤的第一位，且呈逐年上升趋势。近年来，新的放化疗方案及综合治疗方案取得一定进展，常见恶性肿瘤如乳腺癌、结肠癌等5年生存率及生存质量得到有效提高，但就肺癌而言，目前仍无有效的治疗方法改善患者预后，其5年生存率仍然不超过13%。新的抗肿瘤药物研发十分困难，究其原因是由于肿瘤的发生发展机制仍不完全清楚。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)理论的出现在一定程度上为抗癌新药的研发提供了新的视角。该理论认为：肿瘤干细胞是存在于肿瘤细胞中的一个亚群，具有高度自我更新及无限增殖能力，呈不对称分裂，大量研究证实其与肿瘤发生、侵袭、转移及复发密切相关。进一步证据显示，肿瘤干细胞的存在，是肿瘤对放化疗产生抵抗的重要原因之一。因此，对肿瘤干细胞基础理论及调控机制相关信号通路进行深入研究，对发现潜在的药物靶点、进而为临床治疗提供理论基础具有重要意义。作为研究肿瘤干细胞的基础，肿瘤干细胞的分离培养就显得十分关键。但由于肿瘤干细胞含量极少，其分离、富集难度极大，肿瘤干细胞的研究受到严重限制。因此，如何更有效的分离和培养肿瘤干细胞就成为摆在人们面前的一道难题。目前，肿瘤干细胞的分离主要基于细胞表面特异性分子标记及侧群细胞(sidepopulation，SP)。随着研究的发展，人们利用各种分子标记陆续在白血病、脑肿瘤，前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤中发现并成功分选出肿瘤干细胞。但是，肺内细胞种类众多，异质性明显，使肺癌干细胞研究难度加大。肺癌干细胞的研究进展缓慢，目前尚无公认的、特异性的分选标记。研究方法本研究从两个方面对肺癌干细胞进行分离及鉴定：一、探索一种高效分离培养肺癌干细胞的方法，即悬浮球培养方法。运用无血清条件培养基，使肺癌干细胞得到分离和富集。随后，进一步对细胞球的肿瘤干细胞特性进行鉴定。研究采用平皿克隆形成试验、MTT细胞增殖试验、细胞周期检测、流式细胞检测、RT-PCR、免疫荧光技术、Western Blot，检测并比较肺腺癌细胞系A549和A549细胞球的自我更新增殖能力及相关干细胞标记的表达水平；运用扫描电镜方法直接观察并对比贴壁细胞及细胞球表面形态的不同；采用裸鼠移植瘤模型检测两组细胞体内成瘤能力。二、在上述研究基础上，采用平皿克隆形成试验、RT-PCR、免疫荧光技术及裸鼠移植瘤模型，探索并鉴定A549及小细胞肺癌细胞系H446中CD90~+细胞的干细胞特性。研究结果一、无血清培养肺癌干细胞及其鉴定1细胞增殖能力检测采用无血清条件培养基培养A549细胞，使细胞呈悬浮球状态立体生长。平皿克隆形成试验及MTT细胞增殖试验检测A549贴壁细胞和A549细胞球的自我更新体外增殖能力。结果表明，细胞球相对贴壁细胞具有更强的自我更新能力。2干细胞标记物检测流式细胞仪检测A549贴壁细胞和A549细胞球肿瘤干细胞表面分子标记CD133及CD90的表达情况，发现细胞球中CD133阳性及CD90阳性细胞含量高于贴壁细胞。采用RT-PCR、免疫荧光技术、Western Blot检测两组细胞中干细胞转录因子表达，发现细胞球中干细胞转录因子Sox2及Oct4的表达水平明显高于A549贴壁细胞。3细胞周期检测采用流式细胞术分别检测A549贴壁细胞和A549细胞球的细胞周期，发现相对于贴壁细胞，细胞球中细胞DNA合成较少，大多停留在合成前期。4细胞表面形态观察运用扫描电镜技术观察贴壁细胞与细胞球细胞表面形态，结果发现贴壁细胞表面凸起较多，细胞分化增殖旺盛，而细胞球表面较光滑，大多处于不分裂状态。5体内成瘤能力检测建立裸鼠皮下移植瘤模型并进行检测，结果提示细胞球的体内成瘤能力明显高于贴壁细胞。二、肺癌细胞系A549及H446CD90+细胞的干细胞特性鉴定1增值能力检测采用平皿克隆形成及无血清悬浮球培养试验检测A549及H446中CD90~+和CD90~-细胞自我更新体外增值能力，结果提示A549及H446中CD90~+细胞高于CD90~-细胞，CD90~+细胞具有肿瘤干细胞特性。2干细胞标记物检测采用RT-PCR、免疫荧光实验检测两组细胞干细胞标记物表达，结果发现，A549及H446中CD90~+细胞中的CD133、干细胞转录因子Sox2及Oct4的表达水平明显高于CD90~-细胞。3体内成瘤能力检测裸鼠移植瘤模型中的A549CD90~+细胞，其体内成瘤能力要高于CD90~-细胞，CD90~+细胞具有肿瘤干细胞特征。全文结论1利用悬浮球培养方法可以成功分离和富集肺癌干细胞，细胞呈悬浮立体生长，具有更强的自我更新和增殖能力，且高表达肿瘤干细胞分子标记。2在肺腺癌细胞系A549及小细胞肺癌细胞系H446中，CD90~+细胞具有肿瘤干细胞特性，CD90可能是肺癌干细胞表面分子标记。