【摘 要】
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目的:在NRK-52E及HK-2细胞系中,研究EGFR的抑制剂,AG1478,在TGF-β1诱导EGFR激活及EMT发生中的作用。方法:1.在0、24、48及72小时这四个时间点,用TGF-β1(10ng/ml)分别刺激NR
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目的:在NRK-52E及HK-2细胞系中,研究EGFR的抑制剂,AG1478,在TGF-β1诱导EGFR激活及EMT发生中的作用。方法:1.在0、24、48及72小时这四个时间点,用TGF-β1(10ng/ml)分别刺激NRK-52E,HK-2细胞系,然后利用Western Blotting(WB)技术检测这两个细胞系的上皮标志物蛋白E-cadherin和间质标志物蛋白Vimentin的表达情况;然后根据检测结果选取诱导EMT最明显的时间点后用TGF-β1(10ng/ml)刺激这两个细胞系,再用荧光染色试剂对细胞骨架进行染色,看细胞形态的变化。2.在0、0.5、1、3、6及24小时这六个时间点,用TGF-β1(10ng/ml)分别刺激NRK-52E,HK-2细胞系,然后利用WB技术检测这两个细胞系的EGFR在六个时间点的磷酸化情况。3.从方法2中选出TGF-β1诱导EGFR磷酸化最明显的时间点,然后对这两个细胞系进行如下分组处理:空白对照组,TGF-β1组,TGF-β1+AG1478(EGRF的抑制剂)组,AG1478组,其中TGF-β1和AG1478的浓度分别为10ng/ml、10μM,再通过WB技术检测EGFR的磷酸化情况。4.从方法1中选出TGF-β1诱导EMT最明显的时间点,然后对这两个细胞系给予如同方法3的分组处理(TGF-β1和AG1478的处理浓度不变),再通过WB技术检测上皮和间质标志物蛋白的表达情况;同时用荧光染色试剂对细胞骨架进行染色,看细胞形态在不同处理下的变化。结果:1.WB技术检测出这两个细胞系E-cadherin的表达在48及72小时都出现下调,Vimentin的表达在24、48及72小时这三个时间点都出现上调;染色结果:在刺激48小时后细胞出现板状伪足和张力纤维,细胞呈现出梭状的形态。2.WB技术检测出这两个细胞系EGFR的磷酸化水平都在3小时出现显著的上调,并于6小时出现显著的下调。3.根据结果2确定EGFR激活最明显的时间点(3小时)后,WB技术的检测结果如下:TGF-β1组与空白对照组相比EGFR的磷酸化水平出现上调;TGF-β1+AG1478组和AG1478组与TGF-β1组相比EGFR的磷酸化水平出现下调;其他组间结果的计较无统计学差异。4.根据结果1确定诱导EMT最明显的时间点(48小时)后,WB技术的检测结果如下:TGF-β1组与空白对照组相比E-cadherin的表达降低,Vimentin的表达升高;TGF-β1+AG1478组和AG1478组与TGF-β1组相比E-cadherin的表达升高,Vimentin的表达下调;其他组间结果的计较无统计学差异。染色结果:在此时间点下AG1478能显著逆转TGF-β1单独刺激所出现的细胞板状伪足和张力纤维这些明显的形态变化。结论:在NRK-52E、HK-2细胞系中,TGF-β1可诱导EMT的发生以及EGFR的激活;EGFR的抑制剂,AG1478,可通过阻断TGF-β1诱导EGFR的激活达到减轻EMT发生的作用。
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