酪蛋白磷酸肽螯合铁的制备

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用酸沉淀法从脱脂奶粉中制得牛乳酪蛋白,并检测其水分含量;对制得的酪蛋白进行胰蛋白酶水解,应用Ca2+、乙醇沉淀法测得水解液中的酪蛋白肽(CPP)含量;分别研究了Fe3+、Fe2+与CPP螯合的工艺条件,讨论了时间、温度、pH三因素对螯合效果的影响,并确定了最佳螯合条件;利用红外光谱对螯合物进行了鉴定。1.酸沉淀法制备酪蛋白。以脱脂乳粉为原料配制成一定浓度的溶液,用0.5mol/L的盐酸溶液调pH到4.6,静置10min,在3500r/min速度下离心5min,弃去上清液,沉淀物备用。结果表明:该沉淀物水分含量25%。2.胰蛋白酶酶解酪蛋白制得CPP。称取净重5g的酪蛋白沉淀配制成底物浓度为5%的酪蛋白溶液,用胰蛋白酶水解:温度58℃,pH值7.4,酶底比为0.7%,时间2h。酶解结束后将酶解液立即放置于100℃水浴中灭酶5min,冷却至室温。用0.1mol/L的盐酸将冷却后的酶解液pH调至4.6,在5000r/min速度下离心15min,保留上清液。取5mL离心后的酶解液,加入10%的氯化钙溶液0.05 mL,再加95%乙醇溶液2.5 mL,然后在6000r/min速度下离心10min,将沉淀物冷冻干燥、称重。结果表明:该溶液中的CPP粗品含量为0.0144g/mL。3.CPP与Fe3+螯合条件的优化。对螯合条件进行时间、温度、pH值单因素试验,应用磺基水杨酸法测定螯合率,分析了各因素对螯合效果的影响,再用三因素三水平正交试验对螯合条件进行优化,确定最佳螯合条件为:反应时间120min,反应温度80℃,反应pH值为4.5。50℃真空干燥得棕色粉末产品,测定螯合率为93%。4.CPP与Fe2+螯合条件的优化。对螯合条件进行时间、温度、pH值单因素试验,应用菲洛嗪法测定CPP螯合亚铁离子的能力,分析了各因素对螯合效果的影响,再用三因素三水平正交试验对螯合条件进行优化,确定最佳螯合条件为:反应时间140min,反应温度50℃,反应pH值为6.0。50℃真空干燥得浅灰色粉末产品,测定螯合率为96%。5.红外光谱鉴定螯合结果。将未经螯合的CPP粉末与螯合得到的铁肽粉末制品同时进行红外光谱测定,谱图显示:未经螯合的CPP粉末在930-1100波段(即含磷化合物P-N的特征吸收峰位置)有中强吸收,而在螯合得到的铁肽粉末谱图中,该吸收减弱或消失。表明螯合物中单独的P-N键明显减少,推测是P-N键与铁离子结合形成了配位键。
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