通过增强启动子的启动强度来增强目的基因表达,进而提高代谢产物的产量是近年来代谢工程研究的热点。上游元件（UP Elements）是一段富含A和T的DNA片段,能够通过与RNA聚合酶全酶的α亚基羧基末端结构域（αCTD）接触激活RNA聚合酶核心酶来提高启动子的表达强度。本研究将上游元件中非保守序列随机突变的片段与小球藻病毒基因组来源的核心启动子结合为半合成启动子,通过构建双报告基因质粒对随机突变后的上游元件进行筛选;将筛选得到的对启动子表达具有促进作用的上游元件构建在其他核心启动子上,并用双报告基因进行验证;在此基础上通过基因编辑（CRISPR/Cas9）技术将大肠杆菌苏氨酸代谢途径中的内源启动子thr Lp替换为半合成启动子,通过苏氨酸产量对比,进一步验证了筛选得到的半合成启动子具有更强的启动活性。主要研究内容如下:（1）以pKK232-8质粒为模板,通过PCR、酶切及酶连接技术将氯霉素乙酰转移酶基因cat、增强型绿色荧光蛋白基因egfp以及本实验室前期筛选得到的小球藻病毒基因组来源的核心启动子N63构建至载体p KK232-8中,得到p KK232-8-N63-egfp-cat双报告基因质粒,并使用Design Expert12.0根据Box-Behnken（BBD）原理设计实验对培养基进行了优化,以双报告基因质粒转化菌中绿色荧光蛋白的荧光强度作为响应值,得到其最佳表达时的培养基配方为酵母浸粉2.8%,葡萄糖2%,胰蛋白胨2.5%,氯化钠1%,p H7.0,为后续使用双报告基因质粒对含上游元件的半合成启动子进行表达验证奠定了基础。（2）将上游元件非保守序列进行随机化并合成,随后将随机化的上游元件片段与本实验室保存的小球藻病毒基因组来源的核心启动子N63连接构建成含有随机突变上游元件的N63半合成启动子,将半合成启动子构建至egfp-cat双报告基因质粒中,通过在氯霉素终浓度为450μg/m L的优化LB培养基中对随机突变后的上游元件进行筛选,得到一系列对核心启动子启动强度有促进作用的上游元件,将所筛选出的上游元件进行测序,为后续进一步验证其增强作用提供准备。（3）将筛选得到的具有增强启动子活性的上游元件与本实验室保有的小球藻病毒基因组来源的核心启动子N37构建至egfp-cat双报告基因质粒上,利用双报告基因质粒对半合成启动子的启动强度进行进一步检测,通过在氯霉素终浓度为450μg/m L的优化LB培养基中对重组质粒转化菌株进行生长曲线测定,以及使用流式细胞仪对转化菌株进行荧光强度的测定,发现带有上游元件的半合成启动子启动活性更强,说明所筛选出的上游元件除对核心启动子N63启动活性有加强作用外,对核心启动子N37的活性强度也具有同样的加强作用,进一步证明了所筛选出的上游元件的重要性。（4）通过CRISPR/Cas9技术,将大肠杆菌苏氨酸生物合成途径中关键基因操纵子thr ABC的启动子替换为所筛选出的带有上游元件的半合成启动子,构建工程菌E.coli K-12 MG1655Δilv AΔmet AΔlys AΔtdhΔtdc CΔthr Lp::N63UP94p,E.coli K-12 MG1655Δilv AΔmet AΔlys AΔtdhΔtdc CΔthr Lp::N37UP94p,以实验室前期构建的工程菌E.coli K-12MG1655Δilv AΔmet AΔlys AΔtdhΔtdc CΔthr Lp::N63p和E.coli K-12 MG1655Δilv AΔmet AΔlys AΔtdhΔtdc CΔthr Lp::N37p作为对照,同时进行摇瓶发酵并检测产量,敲入半合成启动子的菌株N63UP94的苏氨酸产量从对照菌株的6.8 g/L提高到15.38 g/L,菌株N37UP94的苏氨酸产量从对照菌株的15.05 g/L提高到20.68 g/L,证明所筛选到的上游元件可以通过增强启动子启动强度的方式来提高目标产物的产量。