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目的:过量的锰（manganese,Mn）暴露可通过损伤黑质-纹状体多巴胺（Dopamine,DA）能神经元投射通路造成持续、进行性的锥体外系功能损伤,其症状与帕金森病（Parkinson’s disease,PD）的临床表现类似。虽然目前已进行了一系列关于Mn神经毒性机制的研究,但是对于Mn致黑质-纹状体DA能神经元投射损伤及运动功能障碍的分子机制仍然不明确。此外,对于Mn中毒患者的治疗尚无特效药。因此深入研究Mn诱发黑质-纹状体DA能神经元投射损伤及运动功能障碍的相关机制,对保护Mn暴露人群的健康具有十分重要的现实意义。神经回路的准确建立涉及轴突将神经元导航到它们的目标区域,神经元轴突导向过程对于黑质内的DA能神经元投射到纹状体后释放DA是必不可少的。研究人员发现轴突导向分子在纹状体中大量表达,它们可调节多巴胺能神经元的投射进而影响大脑运动功能。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m~6A）是RNA内最普遍的甲基化修饰之一,可在转录后水平调节基因表达。m~6A修饰可调节RNA剪接、翻译和降解。据报道,m~6A修饰可以调节不同神经元功能,例如运动功能、轴突导向功能和突触功能。m~6A去甲基化酶脂肪量和肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity-associated protein,FTO）的发现表明m~6A修饰可以被动态调节。研究表明,YT521-B同源域家族蛋白2（YT521-B homologous domain family protein 2,YTHDF2）被鉴定为第一个优先识别m~6A的蛋白质,其在识别m~6A后可促进mRNA降解。此外,研究人员发现抑制去甲基化酶FTO会损害神经元活动和运动功能。目前,FTO和YTHDF2能否通过轴突导向分子调控黑质-纹状体DA能神经元投射进而参与Mn诱导的类PD样病变尚需进一步研究。据此,本研究将通过体内动物实验结合体外细胞实验,利用分子生物学、神经行为学、形态学和生物信息学等综合方法,以及构建FTO和关键靶标轴突导向分子促红细胞生成素产生肝细胞配体B2（ephrin-B2）过表达模型,探索Mn经FTO介导的mRNA m~6A甲基化修饰及YTHDF2依赖性的降解途径调控ephrin-B2表达的重要机制,研究轴突导向分子ephrin-B2失调在Mn致DA神经元投射损伤中的关键作用,进一步阐明Mn致神经功能损伤的机制。研究方法:1.选择C57BL/6小鼠（雌雄各半）按体重均衡原则分为8组（n=16）,包括对照组、12.5、25和50 mg/kg Mn Cl2组,以及AAV5阴性对照（Negative Control,NC）组、AAV5-FTO对照组、AAV5-NC+50 mg/kg Mn Cl2组和AAV5-FTO+50 mg/kg Mn Cl2组。对照组小鼠在给予腹腔注射0.9%Na Cl。Mn Cl2组的小鼠给予腹腔注射12.5、25和50 mg/kg Mn Cl2,处理浓度为5 m L/kg。每天染毒一次,连续染毒两周。对于AAV5病毒注射:小鼠经脑立体定位向纹状体区注射0.2μL AAV5-FTO或者AAV5-GFP病毒。行为学实验结束后,16只小鼠中的2只用于荧光金逆行示踪标记实验。随后将所有小鼠在麻醉下断头处死,冰上分离每组其他14只小鼠的纹状体用于纹状体的形态学观察、免疫荧光检测、Mn和DA水平检测,以及确定目标mRNA表达、蛋白质和其他指标水平。2.SH-SY5Y细胞染Mn后用Western blotting和RT-qPCR检测去甲基化酶FTO的mRNA表达和蛋白水平。应用CCK-8法检测Mn对SH-SY5Y细胞活力的影响。采用免疫荧光染色观察FTO表达位置及荧光强度的改变。构建FTO过表达细胞模型:将FTO过表达慢病毒或GFP对照（FTO-NC）慢病毒转染至SH-SY5Y细胞,采用嘌呤霉素筛选后获得稳定过表达FTO的SH-SY5Y细胞。将FTO-NC细胞分为对照组和染Mn组,FTO过表达细胞分为对照组和染Mn组。收集各组细胞的RNA进行RNA-seq实验以筛选FTO潜在的轴突导向分子靶基因。随后应用RT-qPCR实验检测FTO潜在靶基因mRNA表达,以验证RNA-seq的结果。最终应用Me RIP-qPCR实验检测潜在靶基因的mRNA m~6A水平,以筛选得出FTO的关键轴突导向分子靶基因。3.构建FTO和/或YTHDF2过表达细胞模型:将FTO过表达和/或YTHDF2过表达的慢病毒以及GFP对照慢病毒转染至SH-SY5Y细胞,筛选得到稳定的过表达FTO和/或YTHDF2的细胞用于后续实验。将FTO-NC和/或YTHDF2-NC细胞分为对照组和染Mn组,FTO过表达和/或YTHDF2过表达细胞分为对照组和染Mn组。采用放线菌素D实验检测ephrin-B2的mRNA稳定性。检测YTHDF2的mRNA表达和蛋白水平,随后从SH-SY5Y细胞中分离出总RNA后进行RIP-seq实验以识别YTHDF2的目标转录本,以及YTHDF2是否与ephrin-B2存在结合作用。采用Western blotting实验检测ephrin-B2和YTHDF2的蛋白水平。RT-qPCR实验检测ephrin-B2 mRNA的表达。C57BL/6小鼠按体重分为4组,每组16只,包括ephrin-B2-NC对照组、ephrin-B2-NC+50 mg/kg Mn Cl2组、ephrin-B2-NC+20 mg/kg MA2（FTO抑制剂）+50 mg/kg Mn Cl2组、AAV5-ephrin-B2+MA2+50 mg/kg Mn Cl2组。对照组小鼠在接受皮下注射0.9%Na Cl 2 h后给予腹腔注射0.9%Na Cl。Mn Cl2组的小鼠接受皮下注射0.9%Na Cl 2 h后给予腹腔注射50 mg/kg Mn Cl2。MA2组的小鼠接受皮下注射20mg/kg MA2 2 h后给予腹腔注射0.9%Na Cl。MA2+50 mg/kg Mn Cl2组小鼠接受皮下注射20 mg/kg MA2 2 h后给予腹腔注射50 mg/kg Mn Cl2,处理浓度为5m L/kg。每天染毒一次,连续染毒两周。AAV5病毒注射及后续检测指标参考第一部分动物实验。结果:1.小鼠纹状体Mn含量随着染Mn剂量增加而升高,且纹状体内FTO表达显著降低,与正常对照组比较差异有统计学意义。行为学实验观察到50 mg/kg Mn Cl2组小鼠达到疲劳时的奔跑距离、在棒时间、在旷场内的移动距离和移动速度均明显降低。FTO过表达可逆转Mn所致的运动功能损伤症状。HE染色和尼氏染色发现50 mg/kg Mn Cl2组小鼠的纹状体组织病理损伤严重,而FTO过表达可改善Mn暴露引起的损伤症状。荧光金逆行示踪标记及TH和DARPP32荧光双染发现50 mg/kg Mn Cl2组黑质-纹状体DA能投射神经元功能明显受损。FTO过表达后DA能神经元投射损伤有所恢复。此外,纹状体DA含量检测发现50 mg/kg Mn组DA含量明显降低,FTO过表达后DA含量有所上升。2.Western blotting结果和RT-qPCR结果显示Mn暴露明显降低了SH-SY5Y细胞内的FTO表达。CCK-8实验发现Mn暴露后SH-SY5Y的细胞活力明显下降,FTO过表达后细胞活力有所上升。此外,本研究观察到Mn暴露后SH-SY5Y细胞内FTO荧光强度明显降低,表达位置无明显改变。随后,本研究给予细胞FTO过表达干预后进行RNA-seq并通过RT-qPCR筛选了潜在靶基因。分析发现ephrin-B2、NTN4、SLITRK5、SEMA3A以及SEMA7A可能为Mn暴露的细胞模型中FTO潜在的靶基因。本研究应用HESS等发表的特异性敲除小鼠中脑DA能神经元FTO后的Me RIP-seq数据进行了pathway分析。结果观察到FTO敲除后轴突导向信号通路变化十分显著。最终,本实验通过Me RIP-qPCR实验观察到Mn暴露可上调ephrin-B2的mRNA m~6A水平,而FTO过表达后其mRNA m~6A水平有所下降,提示ephrin-B2可能为Mn暴露模型中FTO的关键靶基因。3.放线菌素D实验结果显示Mn暴露降低了ephrin-B2 mRNA的稳定性,而FTO的过表达显著增加了ephrin-B2 mRNA的稳定性。Mn暴露并未对YTHDF2的表达产生影响。随后应用FTO过表达后的RNA-seq结果结合YTHDF2 RIP-seq结果分析发现,ephrin-B2为既可被FTO调控又可与YTHDF2结合的轴突导向分子。RT-qPCR和Western blotting结果观察到FTO过表达干预可拮抗Mn暴露引起的ephrin-B2的表达下降。值得注意的是YTHDF2的过表达显著降低了FTO过表达细胞中ephrin-B2的水平。此外,YTHDF2的过表达在Mn暴露的基础上进一步降低了ephrin-B2 mRNA的稳定性。进一步分析发现,MA2干预加重了Mn暴露致小鼠黑质-纹状体系统的DA能神经元投射损伤以及DA水平的显著降低。此外,在FTO抑制模型中过表达ephrin-B2显著改善了Mn诱导的黑质-纹状体DA能神经元投射损伤和DA含量减少。行为学实验观察到Mn和MA2暴露导致小鼠达到疲劳时的奔跑距离和在转棒上的持续时间显著减少。给予FTO基因抑制模型小鼠ephrin-B2过表达干预显著提高了小鼠在转棒实验和疲劳实验中的表现。结论:1.Mn暴露可下调小鼠纹状体内FTO的表达,进而造成小鼠黑质-纹状体DA能神经元的投射损伤及运动功能障碍。2.Mn可经FTO调控轴突导向分子ephrin-B2的mRNA m~6A修饰,从而影响其表达水平。3.FTO/m~6A/ephrin-B2/YTHDF2信号通路在Mn诱导的DA能神经元投射损伤和运动功能障碍中起关键作用。