目的：通过研究系统阐述高迁移率族蛋白1(high mobility group box chromosomalprotein1，HMGB1）参与类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis， RA）疾病发生、发展和诱导类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（Rheumatoid arthritis synovial fibroblasts,RASFs）形成的分子机制，以及关键的信号通路。方法：为了进一步研究HMGB1-LPS复合物在类风湿关节炎发病机制中的作用及可能的信号通路，我们采取了体内外实验相印证的方法，探讨HMGB1-LPS复合物在类风湿关节炎发病机制中的作用，实验分为两个部分：第一部分：在本部分实验中，我们取经关节置换手术骨关节炎病人滑膜组织分离出的滑膜成纤维细胞与HMGB-LPS复合物共培养5-8代，作为实验组细胞（t-OASF）；取类风湿关节炎滑膜成纤维细胞作为阳性对照（RASF），骨性关节炎滑膜成纤维细胞作为阴性对照（OASF）。细胞均用含有1%FBS的DMEM培养24h后，培养基换成含10%FBS的DMEM再培养24h；收集细胞，用PI染色后采用流式细胞仪分析三组细胞细胞周期的变化，探讨HMGB-LPS复合物对细胞周期的影响，是否能促进细胞增殖。使用凋亡诱导剂处理细胞8小时后，收集细胞经流式细胞仪检测细胞凋亡的情况、Western blotting检测细胞中Bcl-2和Bax表达的变化，探讨HMGB-LPS复合物作用于细胞后能否使细胞的凋亡受到抑制并减少。为了检测三组细胞在一定条件下诱导产生自噬的能力，使用10%FBS的DMEM将细胞在经多聚赖氨酸处理的盖玻片上生长24h后、将培养基换成PBS处理细胞4h，进行免疫荧光染色并用激光共聚焦观察自噬相关蛋白LC3Ⅱ的产生情况；采用Western blotting检测细胞中LC3Ⅱ的表达情况。为了观察三组细胞HMGB-LPS复合物相关受体（TLR2、TLR4和RAGE)及与细胞粘附和迁移相关分子等的表达情况，采用流式细胞仪检测粘附分子（ICAM、VCAM）、趋化因子（CCL2、CXCL12）和相关受体的表达情况。为了明确三组细胞促炎因子和蚀骨的MMPs表达差异，采用ELISA和Real-Time PCR法检测细胞培养上清液和细胞中促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)和MMPs(MMP-3和MMP-13)蛋白水平及mRNA水平的表达情况。为了阐明HMGB1-LPS复合物刺激滑膜成纤维细胞向类风湿关节炎滑膜成纤维细胞转变可能的下游信号通路，我们使用PathScan多靶点蛋白检测试剂盒筛选三组细胞激活的下游信号通路的差异。第二部分：体内实验根据文献（Nat Med.2009；15：1414-1420.）进行。将经HMGB1-LPS复合物诱导的OASFs（t-OASFs）包裹人的正常软骨，将此软骨植入SCID小鼠一侧腹部皮下，两个月后取出软骨经固定包埋后切片进行常规HE染色、阿利新蓝和Masson特殊染色、免疫组化染色等分析和观察，并根据染色结果进行病理评分；比较三组细胞对人软骨造成的损伤程度。结果：1、与OASF组细胞相比较， t-OASF组细胞进入S/G2期明显增多，细胞增殖加快。三组细胞用1%FBS的DMEM培养24h后，将培养基换成含10%FBS的DMEM再培养24h，细胞经PI染色后流式细胞仪检测。结果发现OASF组处于S期的细胞有16.83%，处于G2期的细胞仅有0.07%；t-OASF组处于S期的细胞为30.82%，G2期的细胞为26.96%；RASF组处于S期的细胞为9.17%，G2期细胞为22.28%。与OASF组比较，t-OASF组细胞的增殖明显加快，有更多的细胞越过G1/G2checkpoint进入S/G2期，并与RASF组一致。2、经凋亡诱导剂诱导后t-OASF组细胞凋亡明显降低，促存活蛋白（Bcl-2）表达上调、促凋亡蛋白（Bax）表达降低。文献报道RASFs对于外界刺激可通过降低凋亡的敏感性、从而提高存活率。为了评价t-OASFs对凋亡的敏感性，我们使用TNF-α处理细胞8h后，收集细胞经流式细胞仪检测细胞凋亡情况，发现OASF组凋亡细胞占8.21%，坏死细胞占6.57%；t-OASF组的凋亡细胞占2.74%，坏死细胞占3.16%；RASF组凋亡细胞占1.08%，坏死细胞占2.14%。相比于OASF组，t-OASF组凋亡和坏死的细胞比例大大降低；用westernblotting分别检测Bcl-2和Bax，发现在三组细胞中OASF组细胞Bcl-2的表达明显低于t-OASF组及RASF组，而Bax的表达则明显高于t-OASF组及RASF组细胞。表明t-OASF组细胞与RASF组细胞相似，凋亡-存活平衡机制受损；在遭遇有害刺激时，t-OASF组细胞的存活比例增加。3、t-OASF组细胞自噬增多，逃避凋亡。研究证实RASFs在饥饿或雷帕霉素等处理时，可通过增加自噬来逃避细胞凋亡。为了评价t-OASFs产生自噬的能力，我们将细胞在经多聚赖氨酸处理的盖玻片上生长24h，达到60%的融合度后将培养基换成PBS处理细胞4h（饥饿)，再将细胞做免疫荧光抗体染色、激光共聚焦显微镜观察自噬相关蛋白LC3Ⅱ的产生情况，同时用Westernblotting检测LC3Ⅱ的表达差异。经激光共聚焦显微镜观察发现t-OASF组细胞产生LC3Ⅱ的数量与RASFs相似，明显多于OASF组；Western blotting检测也证实t-OASF组和RASF组细胞LC3Ⅱ的表达明显高于OASF组细胞。这些结果表明：t-OASF组细胞自噬增多，导致细胞凋亡的减少。4、与OASF组细胞相比较，t-OASF组细胞HMGB1-LPS复合物相关受体表达上调。HMGB1生物学活性是通过与细胞表面的相应受体结合，激活一系列下游信号途径来达到的，主要为TLR2、TLR4和RAGE。本课题组前期的研究已发现：RASFs表面TLR2和TLR4的表达上调。为了分析t-OASF组细胞HMGB1-LPS复合物相关受体的表达变化，我们将培养的三组细胞采用流式细胞仪检测TLR2、TLR4和RAGE的表达差异。结果发现与OASF组细胞相比较（TLR2为6.7%、TLR4为18.4%和RAGE为2.6%），t-OASF组细胞表面TLR2、TLR4和RAGE表达明显增加，分别为16.1%、26.1%和9.0%。目前已发现细胞表面的TLR4可在细胞受到某些细胞因子的刺激或长期培养后出现脱落或向胞内翻转，OASFs在体外培养培养5代后，细胞表面的TLR4可以出现向胞内翻转。因此，我们采用流式细胞仪胞内染色分析法观察了RASF组细胞胞内TLR4的表达情况。结果发现RASFs胞内TLR4的表达量为19.8%，表面TLR4的表达量为10.2%,证实体外长期培养后RASF上的TLR4会向胞内翻转。5、t-OASF组细胞与细胞迁移和趋化相关的表面分子表达上调RASFs表面趋化因子受体和粘附分子表达的上调，是导致炎症局部淋巴细胞浸润、免疫病理损伤的关键因素之一。为了明确t-OASF组细胞表面粘附分子和趋化因子受体表达与其他两组细胞的差别，我们采用流式细胞仪对三组细胞进行了检测。结果显示：t-OASF组细胞CCL2、CXCL12、ICAM和VCAM的表达分别为41.6%、42.1%、78.4%和2.8%，均明显高于OASF组细胞（33.4%、21.4%、68.7%和2.0%），与RASF组细胞各分子的表达情况比较相同（55.7%、28.8%、77.2%和5.7%）。提示：HMGB1-LPS复合物可以上调t-OASF组细胞表面趋化因子受体和粘附分子的表达，招募淋巴细胞、单核巨噬细胞等免疫活性细胞在关节局部的浸润。6、t-OASF组细胞炎症相关性信号通路分子NF-κB、SAPK/JNK和p38MAPK明显激活炎症相关性信号通路分子，例如NF-κB、SAPK/JNK等在RASFs趋化因子受体表达上调、MMPs产生增加、凋亡和自噬的控制失调等病理性作用中均至关重要。我们使用商品化的PathScan试剂盒对三组细胞中炎症相关的细胞内关键信号蛋白的激活情况进行了检测，结果显示：t-OASF组细胞NF-κB、SAPK/JNK和MAPK p38的激活水平明显高于OASF组细胞。7、t-OASF组细胞促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）及MMPs mRNA水平和蛋白水平表达上调RASFs表达高水平的促炎因子、趋化因子和MMPs，而促炎因子又可增强RASFs对骨质的破坏。为了评价t-OASF组细胞的激活状态，我们使用Real-Time PCR法检测了三组细胞TNF-α、IL-1β、IL-6及MMP-3、MMP-13mRNA的表达水平；采用ELISA法检测了三组细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6及MMP-3、MMP-13的蛋白表达水平。发现t-OASF组细胞TNF-α、IL-1β、 IL-6及MMP-3、MMP-13mRNA的表达均明显高于OASF组细胞（P<0.05）。t-OASF组细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、 IL-6及MMP-3、MMP-13的水平也显著高于OASF组细胞（P<0.05）。与RASF组细胞相比较，t-OASF组细胞TNF-α、IL-1β、 IL-6及MMP-3、MMP-13mRNA与蛋白水平的表达无明显差异。8、t-OASF组细胞可以诱导SCID小鼠模型中植入的正常软骨出现明显的骨质破坏由于RASFs可以产生大量的MMPs等基质降解酶类，可以造成关节软骨的降解和破坏。为了评价t-OASF组细胞对软骨的致病性，我们将t-OASF组细胞、OASF组细胞和RASF组细胞分别与正常人软骨包埋入可吸收海绵内，均植入SCID小鼠一侧腹部皮下，2个月后取出软骨进行常规病理检查、特殊染色和免疫组化检查。常规病理检查结果发现与植入OASF组细胞的软骨相比，植入t-OASF组细胞的软骨基质遭到较严重的破坏，软骨细胞退化和皱缩明显。阿利新蓝与Masson特殊染色结果显示植入t-OASF组细胞的软骨组织染色变浅，细胞退化明显，表明该软骨组织中胶原和酸性粘多糖成分明显减少，骨质呈严重破坏。免疫组化结果显示植入t-OASF组细胞的软骨人类特异性pro-MMP13表达的阳性细胞显著增多。根据植入软骨的病理检查和染色结果进行病理评分，OASF组平均得分为为1.5、t-OASF组为3.8、RASF组为5，经统计学分析OASF组与t-OASF组的差别存在统计学意义（p<0.01）。结论：我们前期的研究发现HMGB1-LPS复合物可以诱导DBA/1小鼠出现明显的关节炎症病理改变，提示HMGB1-LPS复合物可以介导RASFs的形成，导致RA的病理损伤。在本研究中，我们证实了HMGB1-LPS复合物较长期刺激OASFs，能够促进OASFs转化为RASFs样细胞，具有与RASFs相似的生物学性状，包括该细胞增殖明显，处于S/G2期的细胞增多；并通过促进自噬的产生，减少细胞的凋亡；识别SFs上的TLRs和RAGE受体上调它们的表达，同时激活下游NF-κB、SAPK/JNK和p38MAPK信号通路，导致促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）、趋化因子受体（CCL2、CXCL12）、粘附分子（ICAM、VCAM）的表达和分泌上调。在SCID小鼠模型证实经HMGB1-LPS复合物诱导OASFs转化的RASFs样细胞具有明显的致病性，可以破坏正常软骨组织。上述结果提示：外源性PAMP（LPS）与内源性DAMP（HMGB1）结合形成复合物，可以识别SFs上的TLRs/RAGE受体，引起下游信号通路的激活，造成促炎因子、趋化因子和骨质破坏性酶类产生增加，致使正常SFs转化为RASFs，最终导致RA的发生和发展。