南海软珊瑚共附生放线菌抗香蕉枯萎病活性成分鉴定及抑菌机理研究

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香蕉是热带和亚热带地区重要的经济作物和粮食作物。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌热带4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense tropical race 4,Foc TR4)引起的最为严重的病害之一。生物防治被认为是一种很有前途的防治策略。珊瑚是海洋珊瑚礁生态系统的重要组成部分,有着丰富多样的微生物群落,微生物群落具有部分物种特异性。海洋放线菌,特别是珊瑚共附生放线菌,近年来引起了人们的关注。本研究将海洋微生物特殊性与农业土传性病害相结合,选择中国南海西沙群岛5种软珊瑚为研究对象,分离、筛选和鉴定次级代谢产物具有抗Foc TR4活性的软珊瑚共附生放线菌,并对抗香蕉枯萎病活性化合物进行分离鉴定,及探究其抑菌机理;最后采用盆栽方法对活性菌株进行防效验证,及对土壤微生态环境的影响评价,以期获得新颖、独特、高活性、安全的生物防治剂。1.对中国南海西沙群岛豆荚软珊瑚(Lobophytum sp.)、短指软珊瑚(Sinlaria sp.)、冷柳珊瑚(Iciligorgia sp.)、聚裂丛柳珊瑚(Rumphella aggregata)和小月柳珊瑚(Menella woodin)进行可培养共附生放线菌的分离与鉴定,共分离到11个属132株具有代表性的放线菌,分别是Streptomyces,Ochrobactrum,Nocardiopsis,Pseudonocardia,Marinobacter,Glycomyces,Blastococcus,Saccharomonospora,Kitasatospora,Microbispora和Stenotrophomonas,其中Streptomyces和Saccharomonospora为优势属,分别占总数的71.97%和10.61%。这项研究有助于我们了解软珊瑚共附生微生物群落结构,为次生代谢产物生物活性菌株的筛选提供大量可培养放线菌资源。2.采用平板对峙法和TLC-生物自显影法(TLC-bioautography),对132株软珊瑚共附生放线菌进行抗真菌活性筛选,其中49株表现出抗真菌活性,菌株2-6、2-11和H-7代谢产物表现出较强抗真菌活性。根据形态特征、培养特征、生理生化特征和16s r RNA分子生物学特征,鉴定菌株2-6、2-11和H-7为链霉菌属(Streptomyces sp.)。菌株2-6和H-7分别命名为:Streptomyces sp.2-6和Streptomyces sp.H-7。菌株2-11与最近同源标准株Streptomyces rapamycinicus NRRL B-5491(T)(EF408733)显示出较低相似率,利用全基因组数据进行多相分类鉴定,鉴定菌株2-11为链霉菌属新种,命名为Streptomyces xishaensis 2-11 sp.nov.。为了获得链霉菌2-6、2-11和H-7的高活性代谢产物,从5种发酵培养基中筛选到代谢产物活性最大的M1培养基,采用响应面优化法对发酵条件进行优化。优化后链霉菌2-6的抑菌活性为20.35 mm,较优化前(13.06 mm)提高19.35%;链霉菌2-11的抑菌活性为22.56 mm,较优化前(14.35mm)提高21.56%;菌株H-7的抑菌活性为24.73 mm,较优化前(15.82)提高23.73%。3.运用正、反相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析以及制备高效液相等多种色谱分离手段,从链霉菌2-6、2-11和H-7中分离得到3个抗真菌活性化合物。采用核磁共振、高分辨质谱、红外等多种现代结构鉴定技术,结合文献检索,3个化合物被鉴定为Terrein(A7)、Niphimycin C(M1)和Tetramycins A(H1),对Foc TR4的抑菌活性分别为33.67 mm、30.33 mm和26.33 mm。其中化合物A7是首次从放线菌中分离得到,对植物真菌性病害的抑菌活性属首次报道;化合物M1对植物真菌性病害活性也是首次报道;化合物H1对多种植物病原真菌抑菌活性有相关报道,但对香蕉枯萎病等土传性病害的抑菌活性为首次报道。4.基于香蕉枯萎病(Foc TR4)的肆虐蔓延,以Foc TR4为靶标病原菌,探究化合物A7、M1和H1的抑菌机理。结果表明:3种单体化合物对Foc TR4的EC50分别为25.76μg/m L、21.35μg/m L和17.60μg/m L。3种化合物可引起Foc TR4菌丝表面粗糙、不平整,出现萎缩、变细,发生断裂和破裂,且抑制分生孢子的产生;可造成Foc TR4孢子变形、皱缩、塌陷、弯曲和头部肿胀,发生断裂与破裂;可导致Foc TR4细胞细胞壁变薄,细胞器溶解消失,细胞组织崩解,细胞内形成空泡,囊泡出现,细胞质电子密度增加,线粒体数量明显增多,线粒体表面畸形凹陷、缺乏基质、内外膜清晰可见,嵴肿胀和结构无序;能够诱导激活几丁质酶,水解几丁质生成N-乙酰葡萄糖胺,引起Foc TR4细胞壁损伤。3种活性化合物还能抑制Foc TR4的生物合成,诱导其产生氧化应激与细胞凋亡。经活性化合物处理后,Foc TR4细胞内总糖、总蛋白和脂肪含量均随化合物浓度的增大而逐渐降低;且抑制Foc TR4线粒体ETC复合体酶和TCA关键酶的活性,促使活性氧累积,造成靶标菌氧化应激,导致线粒体结构和功能损伤,细胞代谢紊乱,进而导致细胞坏死。5.基于化合物A7和M1对植物真菌性病害的抑菌活性属首次报道。本章通过盆栽实验,进一步验证了链霉菌2-6和2-11对Foc TR4的防控效果,结果显示,接种Foc TR4的香蕉幼苗经链霉菌2-6和2-11处理后,有效抑制了Foc TR4进入香蕉根部和维管束,也降低了土壤中Foc TR4的数量,病原菌的生长繁殖得到有效防控。高通量测序结果表明,土壤中芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸菌属(Lactobacillus)、柄孢壳菌属(Podospora)、Plectosphaerella、Subulicystidium和线虫草属(Ophiocordyceps)相对丰度显著升高,且随着时间的推移,呈倍数增长;而镰刀菌属(Fusarium)相对丰度在持续降低,在处理后期,分别降低了49.03%和46.66%(P<0.05)。此外,链霉菌2-6和2-11对香蕉植株有促生长作用,与对照相比较,叶绿素含量分别提高27.10%和51.07%,株高分别提高30.46%和12.48%,茎粗分别提高14.52%和15.21%,叶面积分别提高117.32%和111.42%,叶片厚度分别提高13.73%和17.70%,鲜重分别提高38.42%和31.07%,干重分别提高41.61%和39.05%。因此,链霉菌2-6和2-11是防治植物真菌性病害和促进香蕉生长的重要微生物资源。
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