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香蕉是热带和亚热带地区重要的经济作物和粮食作物。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌热带4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense tropical race 4,Foc TR4)引起的最为严重的病害之一。生物防治被认为是一种很有前途的防治策略。珊瑚是海洋珊瑚礁生态系统的重要组成部分,有着丰富多样的微生物群落,微生物群落具有部分物种特异性。海洋放线菌,特别是珊瑚共附生放线菌,近年来引起了人们的关注。本研究将海洋微生物特殊性与农业土传性病害相结合,选择中国南海西沙群岛5种软珊瑚为研究对象,分离、筛选和鉴定次级代谢产物具有抗Foc TR4活性的软珊瑚共附生放线菌,并对抗香蕉枯萎病活性化合物进行分离鉴定,及探究其抑菌机理;最后采用盆栽方法对活性菌株进行防效验证,及对土壤微生态环境的影响评价,以期获得新颖、独特、高活性、安全的生物防治剂。1.对中国南海西沙群岛豆荚软珊瑚(Lobophytum sp.)、短指软珊瑚(Sinlaria sp.)、冷柳珊瑚(Iciligorgia sp.)、聚裂丛柳珊瑚(Rumphella aggregata)和小月柳珊瑚(Menella woodin)进行可培养共附生放线菌的分离与鉴定,共分离到11个属132株具有代表性的放线菌,分别是Streptomyces,Ochrobactrum,Nocardiopsis,Pseudonocardia,Marinobacter,Glycomyces,Blastococcus,Saccharomonospora,Kitasatospora,Microbispora和Stenotrophomonas,其中Streptomyces和Saccharomonospora为优势属,分别占总数的71.97%和10.61%。这项研究有助于我们了解软珊瑚共附生微生物群落结构,为次生代谢产物生物活性菌株的筛选提供大量可培养放线菌资源。2.采用平板对峙法和TLC-生物自显影法(TLC-bioautography),对132株软珊瑚共附生放线菌进行抗真菌活性筛选,其中49株表现出抗真菌活性,菌株2-6、2-11和H-7代谢产物表现出较强抗真菌活性。根据形态特征、培养特征、生理生化特征和16s r RNA分子生物学特征,鉴定菌株2-6、2-11和H-7为链霉菌属(Streptomyces sp.)。菌株2-6和H-7分别命名为:Streptomyces sp.2-6和Streptomyces sp.H-7。菌株2-11与最近同源标准株Streptomyces rapamycinicus NRRL B-5491(T)(EF408733)显示出较低相似率,利用全基因组数据进行多相分类鉴定,鉴定菌株2-11为链霉菌属新种,命名为Streptomyces xishaensis 2-11 sp.nov.。为了获得链霉菌2-6、2-11和H-7的高活性代谢产物,从5种发酵培养基中筛选到代谢产物活性最大的M1培养基,采用响应面优化法对发酵条件进行优化。优化后链霉菌2-6的抑菌活性为20.35 mm,较优化前(13.06 mm)提高19.35%;链霉菌2-11的抑菌活性为22.56 mm,较优化前(14.35mm)提高21.56%;菌株H-7的抑菌活性为24.73 mm,较优化前(15.82)提高23.73%。3.运用正、反相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析以及制备高效液相等多种色谱分离手段,从链霉菌2-6、2-11和H-7中分离得到3个抗真菌活性化合物。采用核磁共振、高分辨质谱、红外等多种现代结构鉴定技术,结合文献检索,3个化合物被鉴定为Terrein(A7)、Niphimycin C(M1)和Tetramycins A(H1),对Foc TR4的抑菌活性分别为33.67 mm、30.33 mm和26.33 mm。其中化合物A7是首次从放线菌中分离得到,对植物真菌性病害的抑菌活性属首次报道;化合物M1对植物真菌性病害活性也是首次报道;化合物H1对多种植物病原真菌抑菌活性有相关报道,但对香蕉枯萎病等土传性病害的抑菌活性为首次报道。4.基于香蕉枯萎病(Foc TR4)的肆虐蔓延,以Foc TR4为靶标病原菌,探究化合物A7、M1和H1的抑菌机理。结果表明:3种单体化合物对Foc TR4的EC50分别为25.76μg/m L、21.35μg/m L和17.60μg/m L。3种化合物可引起Foc TR4菌丝表面粗糙、不平整,出现萎缩、变细,发生断裂和破裂,且抑制分生孢子的产生;可造成Foc TR4孢子变形、皱缩、塌陷、弯曲和头部肿胀,发生断裂与破裂;可导致Foc TR4细胞细胞壁变薄,细胞器溶解消失,细胞组织崩解,细胞内形成空泡,囊泡出现,细胞质电子密度增加,线粒体数量明显增多,线粒体表面畸形凹陷、缺乏基质、内外膜清晰可见,嵴肿胀和结构无序;能够诱导激活几丁质酶,水解几丁质生成N-乙酰葡萄糖胺,引起Foc TR4细胞壁损伤。3种活性化合物还能抑制Foc TR4的生物合成,诱导其产生氧化应激与细胞凋亡。经活性化合物处理后,Foc TR4细胞内总糖、总蛋白和脂肪含量均随化合物浓度的增大而逐渐降低;且抑制Foc TR4线粒体ETC复合体酶和TCA关键酶的活性,促使活性氧累积,造成靶标菌氧化应激,导致线粒体结构和功能损伤,细胞代谢紊乱,进而导致细胞坏死。5.基于化合物A7和M1对植物真菌性病害的抑菌活性属首次报道。本章通过盆栽实验,进一步验证了链霉菌2-6和2-11对Foc TR4的防控效果,结果显示,接种Foc TR4的香蕉幼苗经链霉菌2-6和2-11处理后,有效抑制了Foc TR4进入香蕉根部和维管束,也降低了土壤中Foc TR4的数量,病原菌的生长繁殖得到有效防控。高通量测序结果表明,土壤中芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸菌属(Lactobacillus)、柄孢壳菌属(Podospora)、Plectosphaerella、Subulicystidium和线虫草属(Ophiocordyceps)相对丰度显著升高,且随着时间的推移,呈倍数增长;而镰刀菌属(Fusarium)相对丰度在持续降低,在处理后期,分别降低了49.03%和46.66%(P<0.05)。此外,链霉菌2-6和2-11对香蕉植株有促生长作用,与对照相比较,叶绿素含量分别提高27.10%和51.07%,株高分别提高30.46%和12.48%,茎粗分别提高14.52%和15.21%,叶面积分别提高117.32%和111.42%,叶片厚度分别提高13.73%和17.70%,鲜重分别提高38.42%和31.07%,干重分别提高41.61%和39.05%。因此,链霉菌2-6和2-11是防治植物真菌性病害和促进香蕉生长的重要微生物资源。