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肝硬化是一种慢性、进行性、难治性肝病,由一种或多种病因长期或反复发作引起,是一种严重危害人体健康的难治性疾病。在我国,以肝炎病毒所致的肝硬化最为多见,近年来酒精性肝硬化的发病率也逐年增加。肝硬化在组织病理学上表现为广泛肝细胞变形坏死,肝细胞结节状再生,结缔组织增生及纤维化等改变。其中,肝纤维化是肝硬化的病理发展过程中一个必经环节,即纤维化发展到一定程度,即为肝硬化,也可以认为肝纤维化是早期肝硬化。到肝硬化阶段,肝内组织广泛发生变化,肝小叶结构破坏、重构,假小叶形成,肝组织变“硬”。发展到肝硬化阶段时西医目前还没有有效的治疗方法,传统中医药则相对有一定优势。肝纤维化指肝组织内细胞外基质(ECM)成分过度增生与异常沉积,导致肝脏结构和(或)功能异常的病理变化,结构上表现为肝窦毛细血管化与肝小叶内以及汇管区的纤维化,功能上可以表现为肝功能减退、门静脉高压等。其病因主要由于肝炎病毒、酒精等多种损伤因素长期慢性刺激肝脏,使肝窦内肝星状细胞的活化,胶原等ECM成分代谢失衡,生成大于降解,促使肝脏ECM沉积与组织结构重构。肝纤维化见于大多数不同病因的慢性肝脏疾病中,进一步发展可形成肝硬化,严重影响患者健康与生命。中医学对肝硬化的病机认识认为初起多为湿热、疫毒(急性肝坏死),或为气机不畅而致肝血瘀阻,血瘀日久又可致正气虚损,故治疗多从扶正化瘀入手。中药复方灵丹散(LDP)由灵芝、丹参、鳖甲、茯苓等多味中药组成,具有活血柔肝、利湿的作用。本研究紧密结合肝硬化临床治疗三环节:肝纤维化、腹水、胃肠功能异常;从中药制剂与临床疗效、药效与药理机制,以LDP中药制剂为观察药物、以复方鳖甲软肝片为对照药物,采用60%CC14和橄榄油混合液制备肝纤维化大鼠模型,免疫组化、RT-PCR等法检测腹膜微血管内皮细胞AQP-1蛋白与基因表达和胞内分布变化,探讨LDP效应机制,具体包括:①观察防治肝硬化中药制剂临床疗效(抗HF),为该制剂研制提供药学资料;②揭示中药“利水/利湿”药理新机制,诠释中药“利水/利湿”功效部分本质,为中医药防治肝硬化提供新手段。本研究通过观察LDP对四氯化碳肝纤维化大鼠肝脏功能的影响及对肝纤维化检测指标的影响,阐明LDP对肝纤维化的一般疗效;观察LDP对肝纤维化大鼠腹膜微血管内皮细胞上AQP-1表达的影响,从而探究中药复方LDP利水功效的分子生物学机制。实验一:LDP对四氯化碳所致大鼠肝损伤肝组织病理学、肝功能和肝纤维化的影响目的探讨LDP对四氯化碳肝纤维化大鼠肝组织病理学和肝功能的影响。方法雄性SD大鼠60只,随机分为正常组、模型组、对照组、低、中和高剂量观察组。采用皮下注射四氯化碳制造细胞毒性肝纤维化大鼠模型,各用药组自造模四周起开始灌胃中药,共用药八周。观察肝组织病理及肝功能改变,HA,LN,等的改变,结论:与正常组相比,模型组动物血清AST、ALT、ALP活性升高(P <0.05), TP、Alb、G含量降低,(P <0.05);HA、LN、C-Ⅳ、PCⅢ均有明显上升(P <0.05);对照组,高、中、低剂量组与模型组相比AST、ALT、ALP活性明显下降(P <0.05),TP、Alb、G含量有升高,(P <0.05),HA、LN、C-Ⅳ、PCⅢ均有明显下降(P <0.05)。病理切片观察,模型组出现较为明显的纤维化改变,肝细胞弥漫性脂肪变性,炎症细胞浸润,可见肝细胞坏死区、汇管区有纤维结缔组织增生,肝细胞条索排列紊乱,肝小叶结构紊乱,各用药组则表现为轻度脂肪变性,胶原纤维沉积减少,有少量炎细胞浸润,说明LDP可改善肝纤维化病变,并具有保护肝功能的作用。实验二:LDP对四氯化碳所致大鼠肝纤维腹膜微血管内皮细胞AQP-1蛋白与基因表达的影响目的探讨LDP对腹膜与肝组织AQP-1蛋白和基因表达的调节效应。方法制作组织石蜡切片,AQP-1免疫组织化学检测,进行图像采集及分析。提取总RNA,对RNA样品进行A值测定,计算RNA浓度并进行逆转录,在DNA扩增和PCR循环过程之后进行图像采集及分析。结果AQP-1主要在腹膜微血管内皮细胞膜上表达,模型组大鼠AQP-1表达明显低于正常组大鼠的表达(P <0.05),而各用药组AQP-1表达上调至接近正常组水平(P >0.05)。模型组mRNA表达明显低于其他各组(P <0.05),用药组mRNA表达上调至接近正常组(P >0.05)。结论::1.LDP可明显改善四氯化碳所致大鼠肝损伤的肝功能,明显降低肝损伤后升高的AST和ALT,同时升高血白蛋白和球蛋白,改善肝功能及肝功能损伤引起的其他症状,如低蛋白血症等,提示LDP具有保护肝功能、减轻肝损伤的效应。2.LDP能明显降低血清HA、LN、C-Ⅳ及PCⅢ的水平,降低肝纤维化程度,提示LDP具有减轻大鼠肝组织纤维化作用。3.LDP可上调腹膜微血管内皮细胞AQP-1蛋白表达和AQP-1 mRNA表达,增加腹膜对水的重吸收,使肝硬化的腹水得以改善,提示LDP对肝硬化腹水的调节机制与其对AQP-1的调有关。这可能正是灵丹散/中药“利湿”功效的分子机制