骨质疏松症（osteoporosis,OP）是一种常见的全身性代谢性骨病综合征,其疾病多以骨骼组织微结构破坏、全身骨量减少为主要特点,从而致骨骼组织强度下降、脆性增加,继而大大增加了各种骨折的发病率。绝经后骨质疏松症,又被称为Ⅰ型OP,一般发生在女性绝经后5年左右,以年龄55-70岁的绝经后妇女最为常见。据流行病学调查显示,现全球共有超2亿人患有骨质疏松症,其中我国就有超过9000万人,其发病率已跃居常见病、多发病的第7位[1]。绝经后骨质疏松症的发病基础主要是由于绝经后女性激素水平下降,从而引起的破骨细胞和成骨细胞之间的原有骨吸收-形成平衡被打破,进一步引起骨骼组织结构变化和骨量减少,进一步使骨骼组织的强度减低,最终使得各种骨折的发生。大约有50%的绝经后妇女一生中会出现骨质疏松症造成的骨折,骨折可导致发病部位的疼痛、活动及运动功能下降,更可能引起压疮、血栓、肺部感染等各种并发症的从而使患者死亡率增加。其中根据北美流行病学资料表明,超过50岁的白种女性中,各部位骨质疏松性骨折发生的风险依次为:前臂远端骨折16.9%,髋部骨折17.5%,椎体骨折15.6%,远高于同龄男性相对应的骨折风险,分别为3.0%,6.0%和5.0%[2]。明显增高的骨折发生率（尤其是髋部骨折）容易给老年女性患者本人、家庭及社会造成经济、生活上的各种负担,同时恢复时间长,预后差,致残率高,这些问题均严重影响了老年女性的身心健康。因此,防治绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis,OPM）及其相关伴发的各种骨折始终是近年来骨科、内科临床研究的热点方向之一。目前临床治疗绝经后骨质疏松症有多种方法,临床上也出现了较新的药物,如地舒单抗等,其他还包括双膦酸盐类、激素替代、补钙、饮食改善和增加负重运动等多种方法综合治疗,但由于老年人往往存在较多基础疾病,同时顺应性欠佳,加以药物副作用、药效不稳定及药物费用高等多种原因,相应的治疗效果往往欠佳,各种骨质疏松相关骨折发病率仍未得到有效控制。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）属于一种被发现较早的间充质干细胞,其来源于中胚层,细胞最主要的特点就是具备自完善的我更新能力和高水平的多向分化潜能,可以通过分化成为各种细胞,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种类型[3],在骨骼组织的发育、修复等过程中占据重要位置。包括成骨细胞、脂肪细胞多种细胞等均是由骨髓间充质干细胞分化而来,骨髓间充质干细胞动态影响着成骨细胞分化的动态平衡与骨骼组织改建的稳态平衡。现有研究表明,引发骨质疏松的重要原因就是在骨质疏松的发生过程中,骨髓间充质干细胞的成骨分化能力表现为降低而成脂分化明显升高[4],这种BMMSCs的异常分化状态直接影响着骨骼组织的各种发育过程,但其中具体BMMSCs多向分化如何受到调控,包括其相关机制目前尚不清楚。micro RNA（miRNA）即小RNA,其广泛存在于动植物体内。它们可以发挥多种重要的调控作用于各种生理、病理过程中,作用途径多是以结合靶基因的miRNA的3’-非翻译区从而实现在转录后水平上负向调控相应靶基因的表达。现已经发现,多种miRNA共同参与、调节、控制了 BMMSCs的分化过程,并在调节其命运方面发挥着重要作用。近年来,关于miRNA的相关研究始终是受人关注的热点,随着认识的逐渐加深,人们从各种动植物及病毒中已经发现了 1000余种miRNA,在后续的研究中陆续发现各种miRNA在各种生物的生物学活动中存在非常重要的作用,具体包括脂质的代谢,骨组织的重建、细胞的死亡及凋亡、细胞的增殖分化,甚至肿瘤的发展、侵袭等过程,都受到各类miRNA的调控影响。然而,目前尚不清楚具体哪些miRNA在骨髓间充质干细胞的多向分化过程中起着关键作用,这些miRNA又通过那些分子信号途径来进行骨髓间充质干细胞的功能调控,以及miRNA是否在绝经后骨质疏松症的形成和发生中起着作用,以上问题仍然没有具体研究结果可以解释。现主流观点认为,雌激素水平下降后引起的骨骼组织原有形成和吸收之间的平衡被破坏是绝经后骨质疏松发病的根本原因,进而引起骨骼组织重建紊乱,骨质丢失和脆性增加,进而使得各种骨折风险增大。对于发病过程中破骨细胞被异常激活的内容,既往多国研究者已做了深入探讨,但关于成骨细胞介导的骨形成减少相关现象则鲜有研究。骨髓间充质干细胞作为多潜能干细胞,同时也是理想的组织工程种子细胞,其既是骨骼组织中成骨细胞的来源细胞,又是脂肪细胞的来源细胞,而成骨细胞分化的数量、功能直接受到骨髓间充质干细胞相应数量和功能的影响。现有研究表明,绝经后骨质疏松发病发生的根本原因是由于骨髓间充质干细胞分化异常,主要表现为成骨分化能力降低,同时成脂分化能力出现提高,继而表现为骨髓组织内脂肪细胞的数量上升,对应的成骨细胞数量出现下降[4],但关于骨髓间充质干细胞分化为何失衡的分子机制仍不清楚。BMMSCs相关的成骨-成脂的分化过程较为复杂,多种通路和细胞转录分子共同参与调控,最终共同作用引起其正常分化或异常分化,多种通路、转录因子在其中共同发挥了调控作用。因此,我们在本实验中先行建立了绝经后骨质疏松小鼠模型,并使用从绝经后骨质疏松模型小鼠和正常小鼠之间分离纯化的两种骨髓间充质干细胞进行对比,根据相关研究表明,两种来源的骨髓间充质干细胞经基因芯片筛选后存在miR-181c-5p在正常小鼠及绝经后骨质疏松模型小鼠间存在差异性表达[4],因此本实验选取miR-181c-5p作为研究对象进行下一步的功能研究。通过选取正常来源的骨髓间充质干细胞和骨质疏松模型提取的异常分化状态的骨髓间充质干细胞间存在差异性表达的miR-181c-5p,从作用靶点水平探讨其在绝经后骨质疏松发病过程中影响骨髓间充质干细胞异常分化的作用及机制,进一步加深了对绝经后骨质疏松发病机制的理解,同时明确了绝经后骨质疏松中骨量丢失的根本原因。最终本实验为各种绝经后骨质疏松引起的骨折疾病的预防和治疗提供了重要的指导作用,为绝经后骨质疏松的药物研发提供了新方向和新标靶。研究目的（1）探讨哪些miRNA在绝经后骨质疏松来源的骨髓间充质干细胞与正常骨髓间充质干细胞间存在差异性表达,选取miR-181c-5p进一步讨论其在骨髓间充质干细胞整个成骨-成脂分化过程的调控作用,并确定其作用的靶基因及相关机制。（2）探讨在恢复骨髓间充质干细胞中存在差异表达的miR-181c-5p的表达水平后,能否逆转绝经后骨质疏松来源的骨髓间充质干细胞的异常成骨-成脂分化状态。研究方法（1）首先对小鼠通过卵巢切除法后继续饲养12周,成功建立绝经后骨质疏松小鼠模型,并通过全骨髓法分离、培养两种骨髓间充质干细胞,即绝经后骨质疏松来源的异常骨髓间充质干细胞（O-BMMSCs）和仅进行假手术来源的骨髓间充质干细胞（S-BMMSCs）,根据既往研究最终筛选出两组不同来源的骨髓间充质干细胞之间存在差异性表达的miR-181c-5p进一步研究其功能。（2）使用细胞转染等相关技术,改变两组不同来源的骨髓间充质干细胞中miR-181c-5p的表达水平,将其中的miR-181c-5p过表达或抑制后,继续利用茜素红染色、油红O染色、MTT分析、qRT-PCR及Western blot等相关技术进一步检测,分析miR-181c-5p不同表达水平对于细胞增殖状态的影响,以及miR-181c-5p对其相应成骨-成脂分化能力的具体调节作用。通过靶基因预测软件筛选出miR-181c-5p的候选靶基因为Foxo1,并对靶基因Foxol进行功能验证。（3）在抑制miR-181c-5p在O-BMMSCs中的表达水平后,通过细胞转染等相关技术实现后,采用茜素红染色、油红O染色、qRT-PCR和Western blot等相关技术进一步分析,研究抑制O-BMMSC中miR-181c-5p的表达水平后,对于其异常成骨-成脂分化状态是否存在逆转作用。研究结果（1）通过细胞转染后过表达的miR-181c-5p和抑制miR-181c-5p表达对骨髓间充质干细胞的增殖能力无明显影响。经转染后上调miR-181c-5p在骨髓间充质干细胞中的表达可降低骨髓间充质干细胞的成骨能力,并增强骨髓间充质干细胞的成脂能力;而经转染下调miR-181c-5p在骨髓间充质干细胞中的表达可增强在骨髓间充质干细胞中的的成骨能力,抑制在骨髓间充质干细胞中的成脂能力。靶基因预测软件预测miR-181c-5p的候选靶基因为Foxo1,通过转染上调miR-181c-5p在骨髓间充质干细胞中的表达后,可引起Foxo1蛋白表达的下调;而下调miR-181c-5p在骨髓间充质干细胞中的表达后,可引起Foxo1蛋白表达上调。结合荧光素酶报告可进一步证明,miR-181c-5p与Foxo1之间存在特异性结合。（2）通过细胞转染后下调O-BMMSCs中miR-181c-5p的表达水平,发现Foxo1的蛋白表达出现上调,同时O-BMMSCs中亢进的成脂分化能力被抑制,O-BMMSCs原低下的成骨分化能力得到升高,最终O-BMMSCs存在的异常分化状态得到了部分逆转。研究结论（1）miR-181c-5p主要以对靶基因Foxo1表达的负向调控来进一步完成对骨髓间充质干细胞成骨-成脂分化过程的调控。通过下调O-BMMSCs中miR-181c-5p的过度表达,其已形成的异常成骨-成脂分化状态最终被部分逆转。（2）miR-181c-5p的过度表达存在于整个绝经后骨质疏松症的发生过程中,进而打破了骨髓间充质干细胞原有的成骨-成脂分化平衡,降低了骨髓间充质干细胞的骨形成能力,增加了骨髓间充质干细胞的成脂能力,是引起全身骨组织骨量减少,及骨组织质量下降的原因之一。