手性胺作为一种重要的医药中间体,在农业和化学工业中具有广泛的应用,目前,几乎一半的活性药物成分都至少含有一个手性胺单元,使手性胺成为制药工业中十分有价值的结构砌块。其中,杂环胺类化合物如光学纯的3-氨基哌啶和3-氨基吡咯,具有强大的生物活性,可用于抗细菌、抗病毒、抗肿瘤和抗结核等多种药物的合成。胺的工业化生产主要依赖于烯酰胺的金属催化氢化,但此方法成本昂贵,生产过程危险,污染严重,且生成的胺大多为非手性的。生物酶法合成手性胺以其经济、环保、反应条件温和、制备效率高等逐渐得到关注,其中,利用ω-转氨酶催化相应的前体酮不对称合成手性胺,以其优异的立体选择性成为手性胺工业化生产最具潜力的替代手段之一。本课题以手性杂环胺的高效制备为目的,通过基因挖掘技术开发新型的ω-转氨酶,并通过半理性设计对目标ω-转氨酶进行基于活性的分子改造,为实现手性杂环胺的酶法产业化生产奠定了良好的基础。主要研究内容如下:(1)ω-转氨酶的挖掘与筛选。本课题从Paenarthrobacter aurescens TC1、Alcaligenes faecalis ATCC8750及Aeropyrum pernix K1等9个菌株中共挖掘得到40个ω-转氨酶基因,并成功在大肠杆菌E.coli BL21(DE 3)中实现了异源表达。与实验室现有ω-转氨酶酶库合并后,构成了一个含有300个不同来源不同性质的ω-转氨酶酶库。以含氮杂环酮N-Boc-3-哌啶酮和N-Boc-3-吡咯烷酮为底物进行筛选,最终得到ω-转氨酶Cc-TA,在以异丙胺为氨基供体时,对10 mM N-Boc-3-哌啶酮和N-Boc-3-吡咯烷酮的转化率达到100%。该转氨酶虽然能够催化浓度高达1 M的N-Boc-3-哌啶酮和N-Boc-3-吡咯烷酮,但在反应过程中需要投入大量的催化剂,且反应时间较长。为了提高其工业化应用潜力,需要进一步提高Cc-TA的催化活力,以实现催化工艺的经济性。(2)基于半理性设计提高酶的催化活性。以N-Boc-3-哌啶酮为底物,通过序列比对和分子对接,综合考虑底物的疏水特性,选取突变热点Q25和R424,以营造疏水性空腔和底物通道。首先对Q25进行饱和突变,筛选得到第一轮的最佳突变体Q25F,对于N-Boc-3-哌啶酮的比活力是野生型的8.85倍。在第一轮突变的基础上,进行组合突变,将极性带电荷的R424突变为其他疏水性的氨基酸残基,最终得到了一个双点突变体Cc-TA-Q25F/R424L,对N-Boc-3-哌啶酮的比活力较野生型提高了 15.82倍,kcat/Km值较野生型提高了 35.27倍。利用生物信息学手段对Q25F和R424L位点影响酶催化活力的机制进行分析,从分子结构和相互作用力等方面解释了突变体催化活力提高的原因。(3)转氨酶合成手性杂环胺的工艺建立与优化。在保持催化底物浓度1 M时,探究了不同干菌体投量下对50 mL规模制备(S)-(+)-1-Boc-3-氨基哌啶和(S)-(-)-1-Boc-3-氨基吡咯烷的影响。对于底物N-Boc-3-哌啶酮,干菌体投量为30 g/L时,双点突变体Cc-TA-Q25F/R424L反应6h达到反应平衡,转化率达到了 96%(ee>99.9%);而野生型反应30h才达到反应平衡,转化率为93%;双点突变体Cc-TA-Q25F/R424L在干菌体投量为15 g/L时,反应12h达到反应平衡,转化率达到了 93%,反应时间较野生型在干菌体投量为30 g/L时缩短了18h。对于底物N-Boc-3-吡咯烷酮,在不同干菌体投量下,双点突变体Cc-TA-Q25F/R424L(ee>99.7%)和野生型均在24 h达到反应平衡,突变体转化率略有提高。本课题成功实现了利用ω-转氨酶酶法高效制备高浓度手性杂环胺的目标,为其工业化应用奠定了良好的基础。