论文部分内容阅读
NHE家族是存在于所有真核细胞细胞膜上的一种离子交换蛋白，介导1：1的细胞外钠离子和细胞内氢离子交换，以NHE-1亚型分布最为广泛。NHE在调节细胞内pH(pHi)和细胞容积方面具有关键性意义，它的激活还是启动细胞增殖、基因表达、分化和凋亡等过程的最早反应，与许多疾病(如肿瘤、心血管疾病和糖尿病等)的发生和发展有着密切的关系。 最新提出的以调节肿瘤细胞内pH为目标的基因治疗中，NHE-1备受瞩目。研究表明：NHE-1基因在许多肿瘤细胞，如肺癌、乳腺癌、肝癌、黑色素瘤等细胞中高表达，且其mRNA转录拷贝数比正常细胞增高约10倍，保证了Na~+/H~+泵数量与活性的升高。癌细胞具有无氧糖酵解优势(反巴士德效应)，细胞内代谢产生大量的乳酸和H~+，但癌细胞pHi却能维持在生理范围之内(pHi=7.1-7.2)。Na~+/H~+泵在癌细胞的排酸机制中发挥了主导作用，以利于其恶性生长。本文就着眼于此，探索NHE-1基因在肝癌HepG2细胞增殖与凋亡调控中的意义，以期为肝癌基因治疗提供新靶点。 实验分为两部分： 第一部分，研究了针对NHE-1基因的硫代磷酸型反义寡聚脱氧核糖核苷酸片段(asODN)对HepG2细胞的酸化作用。建立共孵育诱导的细胞凋亡与asODN的时效(HepG2细胞与一定浓度asODN共孵育不同时间)、量效(HepG2细胞与不同浓度NHE-1基因的asODN共孵育24h)关系，动态观察细胞形态改变，应用透射电子显微镜记录细胞超微结构改变以及原位检测细胞凋亡(TUNEL试剂第四军医大学硕士学位论文盒检测)。 第二部分，通过构建反义NHE一基因片段的真核表达载体，筛选出其转染HepGZ细胞的阳性克隆，进一步观察其在裸鼠体内的成瘤效应。 主要结果如下: 1、建立了H即GZ细胞pHi测定的标准曲线;pHi与荧光强度呈显著直线相关关系。 2、测定了HepGZ细胞pHi为7.12士0.04。 3、证实了NHE一1基因的硫代磷酸型反义寡聚脱氧核糖核昔酸片段(asODN)对HepGZ细胞的酸化作用，且呈现明显的剂量效应和时间效应关系。共孵育24h:1 p mol/L的as0DN对H即G2细胞基本无酸化作用;10pmol/L的asODN有一定酸化作用;20 p mol/L asODN的酸化作用最强。选择20 p mol/L as0DN为共孵育浓度:24h后即对H即GZ细胞有强的酸化作用，48h以后酸化作用更加明显。 4、20协mol/L asODN作用HepGZ细胞2住h后，经原位凋亡试剂盒DAB染色，可见大量呈棕色的阳性细胞，而对照组仅见背景着色。 5、20 p mol/L asODN作用HepGZ细胞72h后收集细胞，透射电子显微镜观察到细胞凋亡的典型改变。 6、克隆了NHE一1基因的反义、正义寡聚脱氧核糖核昔酸片段，构建了反义、正义NHE一1基因片段的真核表达载体。 7、含有反义NHE一1基因片段的质粒转染H即G2细胞后，可抑制HepGZ细胞增殖，抑瘤率为32.6%;而正义载体和空载体则对HepGZ细胞的增殖、生长无明显抑制作用。 8、转染了含反义NHE一1基因片段的质粒的HepGZ细胞在裸鼠体内仍可成瘤，但与对照组相比较，成瘤时间有所延长，起到了明显的抑瘤作用，抑瘤率为30.2%;超薄组织切片可检测到大量第四军医大学硕士学位论文早期凋亡细胞。而含正义载体和空载体的HepGZ细胞与对照组比较在裸鼠体内的成瘤作用无明显统计学意义。 小结:从以上结果可见，过表达的NHE一1与肝癌细胞的增殖、恶化密切相关，而通过反义技术抑制肝癌细胞的NHE一1活性、诱导细胞内酸化最终引起细胞凋亡是可行的，转染了含反义NHE一1基因片段的质粒的HePGZ细胞的成瘤性降低更进一步证明了早在19605/19705提出的反义疗法以及通过调节细胞内 pH值治疗肿瘤的新方案有相当广阔的应用前景。我们期待针对NHE一1基因的反义治疗能早日解决肝癌治疗中的“盲点”问题。