论文部分内容阅读
目的心房颤动（房颤,AF）的发病机制十分复杂,包括炎症,氧化应激及钙稳态异常等。黄嘌呤氧化酶（XO）是嘌呤代谢过程的关键酶,其过度激活可使体内氧化应激水平升高。在本研究中,我们探讨了氧化应激和钙调控异常与心房电重构及结构重构的关系,以及黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇对以上病理过程的干预作用。方法本研究的动物实验部分应用了两种糖尿病动物模型:糖尿病兔模型和糖尿病大鼠模型。将90只成年大耳白兔随机分为3组:对照组（C,n=30）,糖尿病组（DM,n=30）及别嘌呤醇干预组（ALLO,n=30）,以四氧嘧啶溶液经兔耳缘静脉注射建立糖尿病兔模型。将成年雄性SD大鼠随机分为3组:对照组（n=30）,糖尿病组（n=30）及别嘌呤醇干预组（n=30）,以链脲佐菌素经大鼠尾静脉注射建立糖尿病大鼠模型。别嘌呤醇干预组在糖尿病模型建立成功后开始给药,药物干预时间为8/6周。在糖尿病兔/大鼠模型建立成功8/6周后,对各组动物进行在体心脏超声检查及血流动力学检测,取血清及组织标本,测定血清氧化应激指标,包括黄嘌呤氧化酶、一氧化氮、超氧化物歧化酶及丙二醛等。通过离体心脏灌流进行电生理研究,测定各组动物心房间传导时间,房室传导周期,心房有效不应期及房颤诱发率。通过马松染色观察心房间质纤维化水平,通过HE染色观察心房肌细胞排列情况。通过免疫组化观察心房组织XO表达情况,通过western blot法检测氧化应激（XO,Mn-SOD）,心肌纤维化及其上游相关蛋白（TGF-β,p-38,P-p38,JNK,P-JNK,ERK,P-ERK）、钙通道调控蛋白(Cav1.2,RyR2,SERCA2a,NCX,FKBP12.6,PLB,P-PLB)及线粒体代谢相关蛋白（TFAM,NRF-1,Drp-1,mfn1）表达情况。利用膜片钳技术测定左心房心肌细胞L型钙电流并利用共聚焦显微镜测定细胞内钙瞬变。为进一步研究钙信号通路上游的调控机制,通过免疫组化,western blot及PCR观察心房组织CaMKII及p-CaMKII蛋白及mRNA表达情况。培养小鼠心房肌细胞系HL-1细胞,将细胞随机分为4组:对照组,血管紧张素II（AngII）刺激组,别嘌呤醇预处理（10μM）+AngII刺激组,别嘌呤醇预处理（100μM）+AngII刺激组。通过检测HL-1细胞中ROS生成及MnSOD等蛋白表达测定各组HL-1细胞氧化应激水平,测定各组细胞CaMKII及p-CaMKII蛋白表达水平。结果超声检查及病理学研究发现,与对照组相比,糖尿病组动物左心室肥厚及心房间质纤维化程度增加,发生明显心脏结构重构。在电生理研究中,糖尿病组动物心房间传导时间及房室传导周期延长,房颤诱发率明显升高,发生明显心脏电重构。糖尿病组兔血清氧化应激指标,包括黄嘌呤氧化酶（XO）、一氧化氮（NO）及丙二醛（MDA）水平明显升高。另外,通过western blot检测蛋白表达发现,氧化应激、纤维化相关蛋白,包括XO,Mn-SOD,NF-κB,TGF-β,P-p38,P-JNK,ERK,P-ERK及线粒体合成代谢相关蛋白,包括TFAM,NRF-1,Drp-1,mfn1在糖尿病心房组织中表达水平均明显升高,应用别嘌呤醇干预可抑制心房结构重构及电重构,降低氧化应激、纤维化蛋白及线粒体合成相关蛋白表达。此外,糖尿病动物心房组织中钙通道蛋白如Cav1.2,NCX表达增加,L型钙电流密度及细胞内钙瞬变幅度均增大,提示糖尿病动物心房细胞内钙离子调控异常,应用别嘌呤醇干预后可改善钙离子通道重构。免疫组化及western blot显示糖尿病组动物心房组织CaMKII及p-CaMKII表达增加,应用别嘌呤醇干预后可降低其表达水平。另外,应用AngII刺激HL-1细胞后ROS生成及MnSOD表达水平有所上调,且CaMKII及p-CaMKII蛋白表达有一定程度升高,给别嘌呤醇干预后可在一定程度降低其水平。结论别嘌呤醇作为一种抗氧化剂,可通过抑制黄嘌呤氧化酶活性,减少体内活性氧的生成,抑制CaMKII活性,从而改善糖尿病兔心房结构重构及电重构,抑制细胞内钙离子调控异常,并改善线粒体代谢异常。因此,别嘌呤醇有可能成为糖尿病相关房颤的一种上游治疗方法。关于别嘌呤醇对房颤的治疗作用尚需进一步研究。