论文部分内容阅读
贝类种类繁多,分布范围广泛,栖息环境多种多样,外部的形态结构以及生理解剖特点可以作为其分类的依据。然而,由于环境的变化,这些外部的分类特征具有极大的可塑性,这就给传统的利用形态特征对贝类进行分类鉴定带来了诸多困难。DNA条形码技术(DNA barcoding)是利用分子生物学技术对物种进行分类的方法,主要是通过PCR扩增和测序获得一段标准同源序列,再将该序列进行多重序列比对和聚类分析,从而将某一个物种准确地归为某一特定类群中的分类鉴定技术。虽然关于COI、12S、16S、18S和28S等基因作为DNA条形码的研究已有很多,但对条形码数据分析总结的研究依然很少,本研究挑选了具有代表性的新腹足目、帘蛤目、贻贝目和珍珠贝目的种类进行条形码数据分析,从而使实现条形码标准基因的筛选验证,以便应用。首先,通过对新腹足目、帘蛤目、贻贝目、和珍珠贝目的COI、16S、18S和28S基因部分序列的分析,进行DNA条形码标准基因的筛选。基于COI基因的序列分析发现,科间差异在基本集中在30%-70%之间,属间差异集中在20%-50%之间,种内差异集中在0.0%-7.5%之间,说明COI基因可以区到不同科、不同属、甚至是同一物种,作为贝类DNA条形码具有可行性。基于16S基因的部分序列我们发现,科间差异在35%-70%,属间差异在10%-45%,种内差异在0.2%-1.5%之间,和COI基因一样,16S也可以用来作为DNA条形码来鉴别分类。而在18S和28S基因部分序列中,科间差异集中在10%-50%,属间差异5%-15%,种内差异基本为0。由此可见,18S和28S基因在区分近缘物种方面不具优势,只适合作为高的分类阶元的分子标记。其次,收集了青岛、烟台、大连、海口、厦门和宁波等地贝类,提取基因组DNA后,分别利用COI和16S通用引物进行PCR扩增,获得COI和16S基因的部分序列,然后对序列进行遗传多样性分析。结果表明,共扩增出74条COI序列,其长度经剪切为578 bp,平均种间遗传距离为0.958,种间的遗传距离大于种内的遗传距离,构建的进化树表明,所获取的贝类明显分为两支,不同地理群体的同一物种首先明显聚在一起,同一目的物种再聚在一起,所筛选的COI序列能够将本研究中的物种全部区分开来。一共获得68条不同贝类的16S部分序列,经剪切之后,长度均为421bp,平均种间遗传距离为0.633。同COI序列的分析结果一样,16S进化树也可已将本研究中的大部分物种区分开来,虽然也分为明显的两支,但习见蛙螺(Bursa rana)和圆顶珠蚌(Unio douglasiae)聚为一支,也不能区分开Solen lamarckii和Meretrix meretrix,说明16S在物种鉴别方面仍有一定的局限性。本研究结果表明,COI和16S均可以作为DNA条形码来区分和鉴别物种。最后,采用PCR技术,扩增了中国胶南、长岛、蓬莱、荣成和韩国统营五个地理群体魁蚶样本的COI、12S、18S和28S基因部分序列,并分析了五个魁蚶地理群体的遗传多样性和系统发育关系。经测序比对分析,分别获得67条776 bp的COI序列、72条443bp的12S序列、75条909 bp的18S序列和75条894bp的28S序列。序列比对结果表明,五个群体75个个体的COI序列中共检测到521个多态位点,39种单倍型,单倍型多样度为0.979,核苷酸多样度为0.05632;12S序列中共检测到292个多态位点,43种单倍型;在18S序列中,五个群体都表现出丰富的遗传多样性,共有74种单倍型,胶南群体多态位点有488个,平均核苷酸差异指数是69.724,核酸多样性指数是0.080,相比于其他群体,此群体的变异位点是最多的,多样性也是最丰富的。基于28S序列,75个个体共有18种单倍型,蓬莱群体多样性是最丰富的。不同个体间的遗传距离和分子系统树分析结果表明,韩国群体与其他四个群体的遗传距离明显偏大,但五个群体共计67个个体基于COI序列的系统进化树结果显示,群体间交叉并不明显。