目的:肺癌是全世界范围最常见的一种恶性肿瘤,患者数目庞大、生存期短都是它的主要特点。谈及病因,肺癌的发生与个人不良生活习惯、外界环境情况、基因遗传等因素有关。在20世纪90年代针对肺癌的细胞毒性治疗还没有有效的选择,进入21世纪,第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的出现带来了重大的突破,接下来又出现了MET抑制剂、针对基因突变、分子靶向治疗等相关药物选择。尽管目前药物的选择相对成熟,但肿瘤的发展是多因素作用的结果,想要实现早期发现早期治疗明确肺癌的发生发展机制分外重要。RUNX,属于后生动物转录因子家族,具有转录因子活性,参与调控生长发育的分化、凋亡、增殖等过程。在肿瘤的发展过程中,他们也作为重要的成员参与其中。RUNX家族由RUNX1、RUNX2、RUNX3共三位成员组成,它们拥有相同的runt结构域（RD）,可以与靶基因的启动子相结合,调节靶基因的转录激活或抑制。RUNX1是第一个被确认为在约10%的AML患者中t（8;21）易位断点处的基因,与AML的发生存在因果关系。在造血细胞中,RUNX1可以影响细胞周期的进程,通过调控细胞周期蛋白D2/D3、CDK抑制剂P21、凋亡相关基因Bcl-2、造血生长因子和/或它们的受体的表达。在胶质母细胞瘤母细胞中,RUNX1通过p38-MAPK信号通路作用诱导MMPs、VEGFA的表达促进细胞转移、侵袭和血管生成。但RUNX1是否参与调控非小细胞肺癌的发生发展尚未明确,于是我们检索了在线数据库发现非小细胞肺癌组织中RUNX1表达量高于正常组织,因此本研究旨在于探讨RUNX1在非小细胞肺癌中发挥的作用及相关的分子机制。研究方法:1.数据库信息检索与分析:通过检索GEPIA、UALCAN在线数据库、Kaplan-Meier数据库,评估RUNX1在非小细胞肺癌组织、正常肺组织中的表达情况,与癌症分期、淋巴结转移、疾病预后的相关性;通过检索KEGG、Bio Carta数据库发掘RUNX1与通路的相关性。2.免疫组织化学染色:对肺癌组织芯片进行RUNX1染色,其中包括58对肺腺癌组织和癌旁正常肺组织、52对肺鳞状细胞癌组织和癌旁正常肺组织。染色主要选择了柠檬酸钠高温高压抗原修复和DAB显色。根据双盲的原则,由两名研究人员对染色强度和染色面积的百分比进行评估。染色强度分为四个等级:0（未表达）,1（弱表达）,2（中度表达）,3（强表达）。染色面积的百分比分为五个等级:0（0%）,1（1%-25%）,2（26%-50%）,3（51%-75%）,4（76%-100%）。染色强度和染色面积相乘结果范围为0–12分,评分≥6分提示RUNX1高表达,＜6分提示RUNX1低表达或不表达。3.细胞培养:用DMEM培养基培养正常肺支气管上皮细胞系HBE;用RPMI1640培养基培养人非小细胞肺癌细胞系A549、H1299、H1975、H292;用MEM培养基培养人非小细胞肺癌细胞系SK-MES-1。培养基胎牛血清的浓度均为10%,共同培养于含有5%二氧化碳的37℃孵育箱中。4.细胞免疫荧光实验:提前一天将一定数量的细胞接种于24孔细胞培养板的爬片上培养。第二天,首先通过滤过的PBS清洗3次,每次5分钟,细胞固定液固定15分钟,0.5%Triton X-100透膜打孔15分钟,3%BSA封闭1.5小时,最后一抗孵育过夜。第三天,首先通过滤过的PBS清洗,荧光二抗避光、室温孵育2小时,DAPI染核10分钟,用防淬灭封片剂进行封片,最后显微镜留图。5.细胞转染、干扰、通路抑制剂和稳转细胞系的构建:根据说明书的使用方法,使用Lipofectamine 3000转染、干扰非小细胞肺癌细胞系。本实验选择A549和H1299细胞系进行转染;选择SK-MES-1和H1299细胞系进行干扰,分别于48小时、72小时后用蛋白免疫印迹实验检测细胞的转染、干扰效率。雷帕霉素（Rapamycin）是mTOR通路抑制剂,在A549、H1299细胞转染24小时后,将100 n M的雷帕霉素加入细胞中培养24小时后进行后续实验。在H1299细胞转染24小时后加入G418进行稳定筛选,稳定筛选培养4周后,进行蛋白免疫印迹实验检测转染效率,稳定转染细胞系构建成功。6.蛋白免疫印迹实验:将细胞清洗晾干后加入细胞裂解液低温裂解,配置等质量蛋白样品（40μg）。首先用10%SDS-PAGE分离蛋白,再转移到PVDF膜上,然后用5%脱脂奶粉室温摇床封闭1小时后裁膜,最后4℃抗体孵育过夜。第二天,TTBS洗膜20分钟,并在室温条件下摇床孵育二抗1小时。然后加入发光液检测蛋白水平,最后用Image J软件来定量评估每个条带的灰度值。7.CCK8增殖实验:2500个细胞/孔铺于96孔板中,铺成5板,连续孵育5天。每天一板每孔加入10μL CCK8试剂,铝箔纸包裹避光孵育2小时后使用酶标仪检测每孔的OD值,设置酶标仪的波长为450 nm。8.集落形成实验:800个细胞/孔铺于6孔板中,在37℃、5%二氧化碳孵育箱中孵育10-15天后PBS洗3次,细胞固定液固定后结晶紫染色,最后用高灵敏度化学发光成像系统拍照计数。9.Transwell实验:将约40000个细胞加入到含有2%胎牛血清的培养基的上室中,再将小室坐到24孔细胞培养板中,底层为20%FBS,于含有5%二氧化碳的37℃恒温孵育箱中培养约22小时后收取。PBS洗细胞,细胞固定液固定后结晶紫染色,最后用显微镜留图、计数。10.划痕实验:当细胞密度长至90%左右时,改为含有1%丝裂霉素的无血清培养基,于37℃孵育箱中孵育2小时,此后用200μl枪头在6孔细胞培养板底部划“井”字,再用PBS缓慢清洗细胞,充分洗去漂浮的细胞,加入10%FBS培养,然后在相同的时间用显微镜拍照取图。11.RT-qPCR实验:使用Trizol法提取细胞的总RNA,然后根据试剂盒的说明进行反转录、q PCR实验。实验结果以GAPDH作为对照,计算目的基因的2-ΔΔCt数值,即基因的相对表达量。12.裸鼠体内成瘤实验:将稳定转染的细胞用无血清培养基配成细胞悬液,注射于每只裸鼠右侧腋下皮下。每份细胞悬液体积为200μl,含有10~7个细胞。无菌培养28天后,使用颈椎脱臼法处死裸鼠,解剖取瘤、测量瘤体大小、瘤体拍照留图。13.ChIP实验、琼脂糖凝胶电泳:待10 cm细胞培养皿中细胞长满后按照试剂盒的步骤逐步实验,最后得到纯化的DNA。琼脂糖凝胶电泳:用2%的琼脂糖凝胶分离Ch IP后得到的DNA样品,恒压电场条件下进行凝胶电泳,结束后通过凝胶成像系统拍照、留图。14.统计学分析:使用Graph Pad prism 8.0版软件进行数据的统计学分析,每组结果用均数±标准差（SD）代表,采用t检验或单因素方差分析进行两组间的比较,所有实验在相同条件下独立重复三次。RUNX1表达与临床病理因素相关性用卡方检验进行分析。P值＜0.05被认为具有统计学意义。结果:1.检索GEPIA和UALCAN数据库发现,在非小细胞肺癌中RUNX1表达量高于正常组织,且与肺癌分期、淋巴结转移相关;检索Kaplan-Meier数据库发现RUNX1与患者不良预后相关。接下来完善组织芯片免疫组化实验,结果提示RUNX1表达与患者TNM分期、淋巴结转移相关,与数据库结果相一致。2.过表达RUNX1促进非小细胞肺癌的增殖、迁移能力,敲减RUNX1的表达抑制非小细胞肺癌的增殖、迁移能力;蛋白免疫印迹证实RUNX1表达上调促进相关功能蛋白的表达,反之亦然。3.数据库预测RUNX1与mTOR通路相关,通过蛋白免疫印迹实验和RT-q PCR实验证实上调RUNX1的表达促进mTOR发生磷酸化,且mTOR的m RNA水平上升;Ch IP实验结果提示RUNX1可以直接调控mTOR转录。4.加入mTOR通路抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）后,与对照组相比,过表达RUNX1对细胞增殖、迁移的促进作用减弱;蛋白免疫印迹实验证实,与对照组相比,过表达RUNX1对相关功能蛋白表达的促进作用减弱。5.RUNX1敲减后PD-L1的蛋白和m RNA水平下降;RUNX1过表达可以升高PD-L1的蛋白和m RNA水平;加入mTOR通路抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）后,与对照组相比,过表达RUNX1对PD-L1表达的促进作用减弱。6.裸鼠成瘤实验中,RUNX1稳定转染组瘤体体积、生长速度高于对照组;瘤体蛋白免疫印迹实验证实RUNX1过表达促进mTOR磷酸化。结论:1.RUNX1在非小细胞肺癌中高表达,与肿瘤TNM分期、淋巴结转移和不良预后有关;2.RUNX1通过激活mTOR通路促进非小细胞肺癌的增殖、迁移;3.RUNX1调控mTOR/PD-L1轴的表达;4.RUNX1在非小细胞肺癌中起促癌作用。