黄曲霉(Aspergillus flavus)是一种机会致病菌,它是造成世界范围内食品污染的重要原因之一。黄曲霉的生长发育以及次级代谢产物的形成受诸多外界环境因素的影响。其中,渗透压是起主要作用的影响因素之一。虽然在酿酒酵母内,渗透压的影响机制已经研究得比较透彻。但是在黄曲霉体内,如何响应渗透压变化以及渗透压改变时如何对产毒进行调控的机制目前还不清楚。所以,本实验进行了黄曲霉高渗甘油途径(HOG)内促分裂原活化蛋白激酶的激酶(MAPKK)AflPbsB蛋白功能的研究。本研究利用同源重组的原理,在体外构建同源片段,对黄曲霉pbsB基因进行敲除,构建了敲除突变株△pbsB。结果发现,敲除突变株与野生型相比,生长受到了抑制。产菌核数量检测结果显示,敲除突变株产菌核的数量显著下降。野生型的菌核数量甚至达到敲除株的两倍以上。从转录水平来看,敲除株的产菌核相关基因nsdC的表达量发生下调。产毒方面的研究结果表明,△pbsB敲除突变株的产毒能力明显下降,野生型是敲除株的两倍以上。但敲除株没有完全丧失产毒能力,还是能够产生少量的毒素。从转录水平来看,敲除株的两个毒素合成结构基因aflD和aflQ的表达量发生下调。产孢方面,△pbsB敲除突变株相比于野生型也有很明显的差异。从数量上来看,野生型的孢子数量比△pbsB敲除突变株的多1倍以上;从微观的分生孢子梗形态来看,野生型与突变株相比,孢子梗发育得更完全,而且更密集,而△pbsB突变株的分生孢子梗数量更少,密度更小,孢子梗发育不完全,孢子梗长度更短,而且顶端的分生孢子数量明显减少。在响应渗透胁迫方面,△pbsB敲除突变株由于缺失了渗透压调节通路至关重要的HOG途径中的MAPKK,变得对渗透压更加敏感,受高渗胁迫的影响更大。在添加氯化钠的培养基中,△pbsB敲除突变株比野生型的抑制率更高,WT抑制率为33.96%,而敲除株的抑制率分别为37.50%与40.98%;而在添加山梨醇的培养基中,△pbsB敲除突变株也比野生型的抑制率高,WT抑制率为10.93%,而敲除株的抑制率分别为30.15%与41.62%。此外,野生型受山梨醇的影响较小,受氯化钠影响较大。在侵染能力方面,缺失了 基因也会使得黄曲霉菌株的侵染能力显著下降。从侵染玉米的结果来看,野生型比△pbsB敲除突变株的菌丝更多、孢子产量更高、产毒能力更强。从侵染花生的结果来看,野生型比△pbsB敲除突变株产生了更多的孢子、产毒能力更强。综合本实验的研究结果可以看出,黄曲霉HOG途径中的MAPKKAflPbsB蛋白对黄曲霉而言至关重要。缺失pbsB基因,黄曲霉菌株生长能力、产菌核能力、产毒能力、产孢子能力、适应高渗胁迫的能力以及侵染能力均会下调。该研究结果可为阐明HOG途径在黄曲霉生长发育和产毒中作用提供依据,为生产生活中黄曲霉防治奠定了一定的理论基础。