研究背景尽管目前冠心病的诊疗措施取得较大的进展,冠心病仍然是世界范围内发病和死亡的主要原因之一。2010年我国有近360万人死于心血管疾病,平均每天逾9,800人死于心血管病。急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)为冠心病急症,其包括不稳定型心绞痛、急性心肌梗死、心性猝死等一系列临床病理生理状态。易损斑块破裂、继发血栓形成,使血流急剧减少或者完全阻断,是ACS的主要病理生理基础。一般认为易损斑块的形态学特征包括：薄纤维帽(<65μ m)、大脂质核心、大量激活巨噬细胞及炎症浸润。目前认为导致易损斑块破裂的原因有脂质核心的扩大、斑块内炎症、细胞外基质合成减少及降解增加,局部应力增加等。虽然关于易损斑块破裂的机制研究取得重大进展,但易损斑块破裂的机制尚不完全清楚,仍存在一些矛盾的地方,需进一步识别影响斑块稳定性的其他因素,促使其向稳定方向转化,对于预防急性心血管事件的发生具有重要意义,也是临床上目前需要急待解决的关键问题。钙化是动脉粥样硬化的一个显著特征。与之前的体积较大的钙化不同,近期利用高分辨率的激光共聚焦显微镜和micro-ct发现一种直径在微米水平的点状钙化,称为微钙化。微钙化在斑块内分布广泛,纤维帽、脂质核心中均可发现微钙化。微钙化对斑块稳定性的影响愈发受到关注。Vengrenyuk等首次利用Goodier数学模型证实薄纤维帽处(<65μm)的微钙化可使其周围的应力加倍,引起界面分离,导致斑块破裂。随后学者又利用数学模型证实微钙化的空间位置及形态影响其对斑块稳定性的作用。狭长形微钙化比球形微钙化增加的应力更多。微钙化能解释某些目前解释不清的斑块破裂,成为新的重要的影响斑块稳定性的因素。但目前仍存在一些问题,对微钙化的研究都是基于三维模拟及数学模型分析,它的准确性尚需进行体内实验验证。相关的微钙化动物模型缺乏,限制微钙化的体内研究。因此建立微钙化动脉粥样硬化斑块动物模型及可识别微钙化的病理学染色方法成为体内验证、进一步研究微钙化的关键。动脉粥样硬化的发生与局部的血流动力学因素密切相关。血流与内皮细胞表面摩擦产生的剪切力在内皮细胞功能障碍及动脉粥样硬化进程中作用重大。低剪切力和振荡剪切力是造成动脉粥样硬化病变非随机灶性分布的主要因素。内皮细胞膜表面的力学敏感受体识别剪切力信号并将其转化为细胞内的生化信号,引起内皮细胞结构和功能的改变。低剪切力、振荡剪切力作用下,内皮细胞高表达细胞粘附分子、活性氧产生增多,促进单核细胞粘附、低密度脂蛋白氧化修饰,加速动脉粥样硬化发生。血流剪切力的变化不仅参与动脉粥样硬化的发生,且与斑块内钙化密切相关。Stefan等通过血管内超声及虚拟组织显像技术分析冠状动脉分支处斑块负荷及组织成份,发现在分支的对侧壁,即一般认为的低剪切力区,斑块负荷大且钙化严重。利用符合流体力学原理的套管可实现同时模拟不同形式的剪切力。目前兔腹主动脉内皮球囊机械性损伤加高脂饲料喂养是复制动脉粥样硬化的传统模型。在该模型中,可见斑块内富含脂质、胶原,炎性细胞浸润亦可在该类动物模型中得以复制,但钙化发生较少。为建立合适的微钙化动脉粥样硬化兔模型,需对传统模型加以改进。鉴于血流剪切力对动脉粥样硬化及钙化的影响,本实验意在传统模型的基础上引入腹主动脉套管缩窄术,模拟不同形式的剪切力,在内皮损伤炎症、高脂环境、血流剪切力三重因素作用下,以期建立微钙化动脉粥样硬化斑块模型,使微钙化的体内验证成为可能。茜素红S (Alizarin red s)和冯·科萨(Von kossa)染色是组织学上常用的钙质染色技术。二者的原理不同,冯·科萨染色利用硝酸银溶液与钙盐的磷酸根或碳酸根反应生成相应的磷酸银或碳酸银,后者可被日光或者紫外线还原为黑灰或黑色的金属银；茜素红S通过结构中的硫酸基团及羟基基团与钙离子反应形成粉红色或红色钙盐。茜素红S染料具有荧光活性,染色结果可利用分辨率高的激光共聚焦显微镜观察。利用本实验建立的微钙化动脉粥样硬化斑块模型对比茜素红S和冯·科萨这两种常用的钙质染色技术用于微钙化染色的可行性和异同点,为日后进一步研究微钙化提供技术支持。研究内容(1)建立微钙化动脉粥样硬化斑块兔模型(2)比较茜素红s和冯·科萨染色用于微钙化染色的可行性和异同点研究方法30只雄性新西兰兔,在高脂饲料喂养和腹主动脉内皮球囊损伤基础上,随机分为套管组(给予腹主动脉双楔形套管缩窄)和非套管组,每组各15只,喂养12周。应用体表超声检查两组术前及术后12周腹主动脉的平均血流速度、舒张末期内径,同时检测血液粘滞度,计算术前及术后12周的血流剪切力。安乐死动物后,取两组相对应的腹主动脉为组织标本,制成石蜡、冰冻切片。通过常规的病理学染色及免疫组织化学测定斑块内脂质、胶原、平滑肌细胞、巨噬细胞的含量。对连续的石蜡切片分别进行茜素红S和冯·科萨染色,染色结果在普通光学显微镜、激光共聚焦显微镜下观察。研究结果(1)套管组和非套管组均形成动脉粥样硬化斑块。(2)套管组微钙化发生率和钙化面积高于非套管组(P<0.05)。(3)茜素红s和冯·科萨染色识别微钙化的敏感性相同,前者具有荧光活性的优势,但对于微钙化的定位准确性逊于后者。结论(1)在腹主动脉内皮球囊损伤加高脂饲料喂养的传统模型基础上引入腹主动脉套管缩窄,成功建立了微钙化动脉粥样硬化斑块兔模型。(2)茜素红s和冯·科萨染色均能较好的识别微钙化。