整合素β1基因调控鲤抗CyHV-3感染分子机制研究初探

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:zangye
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鲤疱疹病毒3型(Cy HV-3)是一种传播速度快、致死率可高达90%以上的病毒,在鲤(Cyprinus carpio)和锦鲤(Cyprinus carpio)当中是一种具有常发性和致命性疾病的病原,给鲤养殖业造成了无法计量的严重经济损失。因此从遗传基因的角度研究鱼类抗病遗传调控机理,从而进行抗病育种已经迫在眉睫。目前,已经对鲤抗疱疹病毒(Cy HV-3)开展了选育方面的研究,当前已经选育到了F4,其抗病的性状已达到稳定。本研究将整合素基因与鲤抗疱疹病毒(Cy HV-3)及其相关基因(TK、ORF72)相结合,以镜鲤抗疱疹病毒(Cy HV-3)F4为实验材料,攻毒感染后利用实时荧光定量PCR技术,分析镜鲤抗疱疹病毒(Cy HV-3)F4在不同感染阶段病毒表达量,通过RACE技术克隆鲤整合素β1基因全长序列,分别确定整合素β1基因在鲤十个组织中和在Cy HV-3病毒感染在不同时期脾、肾组织中的相对表达情况,对整合素β1基因调控鲤抗Cy HV-3感染分子机制进行进一步的研究。研究结果如下:Cy HV-3病毒表达量比较:本研究以F4为实验材料,利用实时荧光定量PCR技术以TK和ORF72基因为病毒标志基因,分析镜鲤抗疱疹病毒(Cy HV-3)选育抗病品系F4在病毒感染不同阶段中的病毒表达量。选育组抗病成活率为87.3%,未选育组抗病成活率为62.3%,选育组的成活率高于未选育组,说明选育组的抗病性能强于未选育组。从病毒表达角度探讨F4抗病选育效果及其病毒表达模式:(1)两个基因不同感染阶段脾、肾组织病毒表达量趋势一致,24~144h呈上升趋势,144~288h呈下降趋势。选育组脾在144h相比其他时期差异显著(P<0.05);未选育组脾、肾及选育组肾在144h相比其他时期差异极显著(P<0.01)(2)脾组织两个基因病毒表达量均低于肾组织。选育组和未选育组两个基因均在96~144h差异显著,其中选育组两个基因在96h、ORF72基因144h差异显著(P<0.05),其他时期差异极显著(P<0.01)。(3)选育组两个基因病毒表达量低于未选育组。脾组织两个基因均在96~168h相对表达差异极显著(P<0.01),其中ORF72基因相对表达在192h、216h也差异极显著(P<0.01);肾组织两个基因病毒表达量在96h-168h差异极显著(P<0.01);其中ORF72基因相对表达在192h也差异极显著(P<0.01)。以上结果说明选育组抗病性能强于未选育组,其中肾组织抗病性能强于脾组织,且经选育提高了肾组织抗病免疫性能。鲤整合素β1基因的克隆:通过RACE技术,获得鲤整合素β1基因全长c DNA为3835bp,ORF为2394bp,编码797个氨基酸,预测其分子质量为88.42k Da,等电点PI为6.018。整合素β1蛋白中含有92个强碱性氨基酸(K、R),104个强酸性氨基酸(D、E),219个疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)以及257个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。同时发现整合素β1蛋白的亲水性大于疏水性。鲤整合素β1基因在进化上具有高度的保守性,并与斑马鱼整合素β1a亲缘关系最近。整合素β1基因在鲤各个组织中的相对表达:本实验分析了整合素β1基因在肠、鳃、肾、肝、心、眼、脑、脾、精巢和卵巢这十个组织中的相对表达情况。结果表明,整合素β1基因在鲤组织中广泛表达,其中在肠和鳃组织中高表达。与此相反,整合素β1在精巢、卵巢组织中的表达水平相对较低,与肝、心、眼、脑和脾组织这五种组织间差异极显著(P<0.001),且对比精巢和卵巢组织,这两种组织之间表达水平也呈现极显著差异(P<0.001)。整合素β1基因在鲤Cy HV-3病毒攻毒感染中的相对表达:本实验采用荧光定量PCR技术分析了整合素β1基因在脾、肾组织中的基因相对表达情况。结果表明,整合素β1基因的相对表达在病毒感染早期48h最高,与对照组相比达到了极显著的差异(P<0.01)。随着感染时间的延长,整合素β1基因的相对表达逐渐降低。此外,在Cy HV-3感染早期,肾组织中整合素β1基因相对表达显著增加,并随着感染时间的延长而逐渐减少,但对其在F4体内抗Cy HV-3的作用尚需进一步研究。目前鲤全基因组序列工作已经完成,但对鲤整合素β1的序列及功能尚未完全阐明。因此,本研究克隆了鲤整合素β1基因全长序列,预测分析了鲤整合素β1基因分子的结构特征。确定了整合素β1基因在镜鲤不同组织中的表达,表明其可能在镜鲤的免疫反应中起重要作用。此外,确定了整合素β1基因在脾肾组织中Cy HV-3不同感染期差异表达,明确了在Cy HV-3病毒感染前期,镜鲤脾和肾组织中整合素β1基因相对表达显著升高,为进一步研究抗病镜鲤整合素β1的分子机制及抗病机理提供了理论支持。
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