【摘 要】
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维生素D受体(VDR)为核转录因子,在组织中广泛表达,通过与启动子结合调控基因转录。课题组前期发现VDR敲除小鼠生殖能力显著下降,推测VDR可能调控激素合成和生殖发育相关基因的表达,进而影响雄性生殖性能。本研究基于WT和VDR-/-小鼠睾丸组织蛋白组分析数据,发现VDR敲除后HSD3B1表达显著降低。HSD3B1是负责多种组织中雄激素、孕激素和糖皮质激素等激素中间类固醇生成反应的酶,因此,揭示VD
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维生素D受体(VDR)为核转录因子,在组织中广泛表达,通过与启动子结合调控基因转录。课题组前期发现VDR敲除小鼠生殖能力显著下降,推测VDR可能调控激素合成和生殖发育相关基因的表达,进而影响雄性生殖性能。本研究基于WT和VDR-/-小鼠睾丸组织蛋白组分析数据,发现VDR敲除后HSD3B1表达显著降低。HSD3B1是负责多种组织中雄激素、孕激素和糖皮质激素等激素中间类固醇生成反应的酶,因此,揭示VDR调控HSD3B1基因表达调控及激素合成的分子机制对于雄性生殖领域的研究具有重要意义。本研究首先进行HSD3B1基因的表达谱分析,同时通过生物信息学手段分析基因启动子区维生素D反应元件(VDRE)的分布,按照VDRE分布区域,构建启动子区不同区段荧光素酶报告载体,进行不同VDRE的活性鉴定,并通过定点突变进一步验证了VDRE的功能,系统探究了VDR调控HSD3B1基因表达的分子机制,最后在TM3细胞中超表达HSD3B1初步探讨了其对脂代谢和激素合成的影响,该研究结果为后续VDR与雄性生殖的研究奠定了基础。本研究获得以下实验结果:1.利用RT-qPCR绘制HSD3B1基因组织表达谱,发现其在睾丸、肝脏和肾脏高表达;睾丸组织免疫组化实验显示HSD3B1定位于睾丸间质,且小鼠VDR敲除后,HSD3B1蛋白表达量显著下降,同时睾丸生精小管与间质组织中的间隙明显增宽;在睾丸间质细胞中VDR对HSD3B1有正向调控作用。2.通过NCBI数据库获得HSD3B1转录起始位点前2000 bp和后180 bp的调控序列,生物信息学分析在-1718—-1668 bp和-300—-250 bp两处预测到得分较高启动子,但无CpG岛存在,根据此成功构建启动子区双荧光素酶报告载体,转染293T细胞鉴定活性,结果显示F1片段启动子活性比F2片段更高,且VDR对启动子活性具有激活作用。3.利用转录因子结合位点预测软件分析F1片段,筛选得到-225—-220 bp(TGAACC)和-309—-304 bp(AGGACA)两个潜在的VDRE,通过构建不同的突变载体,鉴定确认-225—-220 bp(TGAACC)是VDR特异性调控位点。4.通过构建HSD3B1基因超表达载体,Elisa实验证明VDR和HSD3B1均促进TM3细胞中睾酮合成;HSD3B1能够上调脂代谢通路基因LPL和Angptl4调控小鼠脂代谢途径,从而间接影响小鼠雄性生殖能力。
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