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传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的禽类一种急性、高度传染性和免疫抑制性疾病。IBDV感染的靶器官主要为雏鸡的法氏囊,感染后引起法氏囊损伤。本实验室前期研究发现IBDV的非结构蛋白VP4通过与糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白(Glucocorticoid-induced leucine zipper,GILZ)相互作用抑制宿主细胞I型干扰素的表达,从而导致免疫抑制,但其相互作用引起免疫抑制的机制尚不清楚。本研究利用荧光定量PCR、免疫共沉淀和体内外泛素化检测系统等实验方法探索VP4与GILZ相互作用过程中GILZ发生的多聚泛素化修饰过程(Polyubiquitination),从而解析IBDV VP4引起免疫抑制过程中发生的信号转导过程,为揭示IBDV引起细胞免疫抑制的分子机理提供理论依据。本研究利用双荧光素酶报告基因检测系统、荧光定量PCR等方法进一步验证了 VP4蛋白可以抑制鸡胚成纤维细胞(DF-1)中I型干扰素的表达,并且找到了 VP4发挥功能作用的关键氨基酸区域,该区域位于41-50aa。与此同时,我们利用点突变技术进一步确定了第41位精氨酸(R41)是其发挥作用的关键氨基酸,将该氨基酸突变后VP4对I型干扰素产生的负调控作用消失。随后的研究发现,GILZ的半衰期较短,平均为2.48 h,其降解可被泛素蛋白酶体抑制剂MG132抑制,说明其主要依赖于泛素-蛋白酶体途径降解。同时,在不同宿主细胞中过表达GILZ蛋白和多种类型的泛素分子均能检测到GILZ的多聚泛素化;当在细胞内同时过表达VP4蛋白时,则可以明显抑制GILZ的泛素化,主要针对其K48类型泛素化,而对K63类型泛素化则无明显影响。此外,当用IBDV感染DF-1细胞时,随着感染时间的延长,GILZ的泛素化水平被明显地抑制。进一步的研究发现,不同种属的GILZ蛋白均可以在体外发生泛素化反应,而且这一反应不需要依赖E3泛素连接酶。通过大肠杆菌表达系统表达并纯化不同截短长度的GILZ蛋白后进行体外泛素化反应,其中GILZ的PER区域(多聚脯氨酸聚集区,98-139aa)具备结合泛素分子的能力,并且这一生化过程和传统的泛素化反应类似。综上所述,本研究发现GILZ蛋白可以发生多种类型的泛素化修饰,IBDV VP4蛋白可以抑制GILZ的泛素化,尤其是K48类型泛素化;同时,不同种属的GILZ蛋白均可以发生体外泛素化修饰,且这一过程不依赖于E3泛素连接酶。这些实验结果为深入了解IBDV诱导细胞免疫抑制提供了重要的理论依据。