研究背景和目的作为中国传统文化的瑰宝,中医药以其独特的理论体系和良好而确切的临床疗效,几千年来为国人的健康事业作出了巨大的贡献。近些年来,随着人们健康观念的转变和医学模式的变更,中医药在各类疾病的预防和治疗上更展现出了独特的优势。肿瘤尤其是恶性肿瘤是危害人类生命和健康最严重的疾病之一。根据中医学理论,肿瘤的产生因为是阴阳失衡,气血不调,五脏之气机紊乱。中药治疗肿瘤是在辨证论治基础上,给予扶正固本、软坚散结、活血化瘀、理气行滞、清热解毒等方法进行整体观的治疗。近年来,随着中药抗肿瘤的实验研究和临床应用的深入开展,中药及其活性成分在肿瘤放化疗时的增效减毒、提高患者整体免疫机能、改善临床症状和提高生命质量等方面的作用日趋凸显,使得中药抗肿瘤越来越受到国际社会的认可和接受。现代临床研究者们从分子生物学和分子药理学的角度对中药抗肿瘤的机制进行了广泛的探索,发现中药抗肿瘤具有多靶点、多效应、多环节的特点,但其抗肿瘤的复杂机制尚不完全清楚,特别是中药对于肿瘤微环境、肿瘤的免疫逃逸和肿瘤耐药的调控,都有待更加深入地研究。外泌体广泛分布于人体各种体液中。作为细胞间物质交换和信息传递的信使,外泌体不仅参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,还介导了肿瘤细胞的免疫逃逸和耐药等过程。目前外泌体作为理想的液体活检标志物和药物载体已被用于多种肿瘤的诊断、监测和治疗。近些年来,亦有许多中药单体、复方和中药活性成分被发现能通过调控外泌体释放来发挥抗肿瘤作用,这使得外泌体有望成为肿瘤治疗新的靶点。因此,研究中药如何调控肿瘤来源的外泌体将具有十分重要的意义,而如何快速、准确地监测肿瘤外泌体在中药作用肿瘤时发生的变化是研究者们首先需要关注和探索的问题。当前报道的文献中主要是采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和蛋白免疫印迹法(WB)等传统分析方法来检测外泌体。这些检测方法虽然经典可靠,但是灵敏度和特异性有限,实验所需要的仪器设备和试剂成本较高,而且操作步骤繁琐耗时。所以,发展简单快捷、准确可靠、灵敏特异且成本低廉的新技术和新方法来实施外泌体的检测分析显得尤为重要。由于具有灵敏度高、特异性好、快速、准确和方便的特点,生物传感检测已被广泛应用于环境卫生和临床医药等领域。目前已有多种生物传感技术用于外泌体的检测,如电化学、表面等离子共振、表面声波、场效应晶体管等。这些基于界面修饰的外泌体生物传感技术具有较高的灵敏度,但是其生物传感器件的制备通常需要复杂的纳米制备工艺或者繁琐的界面工程,并且大多数生物传感技术都以昂贵的抗体来作为外泌体的识别元件。然而,在临床常规实验室中,可靠有效且成本合理的外泌体检测仍然是个艰难的任务,主要问题在于缺乏足够简易和快速的测定平台。脱氧核糖核酸(DNA)是生物体内遗传信息的重要载体。随着DNA固相合成技术的发展,人工合成DNA的成本显著降低。体外合成的DNA可以作为功能性分子或纳米材料发挥很多重要的功能。DNA可作为核酸探针对其互补序列进行特异性识别,也能作为核酸适体来靶向识别结合包括小分子有机化合物、无机金属离子、蛋白质、多肽、微囊泡甚至细胞和组织在内的各种靶标。将DNA的生物识别属性与一些纳米材料(如氧化石墨烯、碳纳米管等)的优良传感特性和信号转导机制相结合,可通过各种常规实验室检测平台(如荧光分析、比色分析等)实现对包括外泌体在内的各种生物样本的高灵敏检测。值得注意的是,DNA本身还可利用互补链之间严格的碱基互补配对自组装形成结构有序、功能可控的DNA纳米材料,并可构建成为对外泌体具有信号响应功能和信号扩增功能的DNA纳米分子机器。鉴于外泌体的纳米尺度,功能化DNA组件和外泌体都限制在同一个纳米空间内,反应物有效浓度将得到极大的提高,能够实现检测信号的快速放大。本研究拟利用功能化DNA的生物识别特性,结合纳米材料和DNA纳米分子机器的信号转导功能和信号扩增功能,设计均相体系中基于荧光分析的纳米生物传感技术,用于外泌体及其表型分子的检测。采用此技术分析肿瘤来源的外泌体,不仅可以准确反映肿瘤发生时的外泌体丰度及表型特征,也可以实时监测各种药物作用肿瘤的过程中外泌体发生的变化,这对于研究中药抗肿瘤机制以及抗肿瘤效果均具有十分重要的意义。方法与结果本研究首先制备了基于DNase I催化的氧化石墨烯核酸适配体纳米探针,用于肿瘤外泌体的高灵敏检测和表型分析;然后构建了外泌体激活的无酶放大的多价DNA纳米分子机器实现了外泌体的超灵敏检测以及表型分子的双色检测,并可用于肿瘤的免疫治疗监测。在此基础之上,运用构建的传感器监测中药活性成分对肿瘤外泌体及外泌体PD-L1的调控。本课题的主要内容包括以下三个部分:第一部分:基于核酸适体纳米探针的ExoAPP技术用于外泌体定量和表型分析外泌体的膜表面及囊泡内携带有多种生物活性分子,多为核酸、蛋白质、多肽和脂质等。由于外泌体的分子特征可以精确地反映其生物来源,因此肿瘤外泌体正逐渐成为肿瘤诊断的新型标志物。然而体液中外泌体的分子表达谱精准分析和定量检测在技术上仍具有很大挑战。针对这一问题,构建了一种基于核酸适体纳米探针的ExoAPP技术用于肿瘤外泌体表型分析和检测。ExoAPP通过氧化石墨烯和靶向外泌体表面特定蛋白的适体荧光探针相结合形成“Off”纳米探针复合物。在DNase I参与下,核酸适体纳米复合物探针可反复识别目标外泌体,不断循环放大荧光信号“On”,从而可甄别外泌体表面标志物的细微变化,实现了5种不同来源外泌体的表型分析,揭示了外泌体的异质性。相比已报道的外泌体均相检测方法,ExoAPP的灵敏度至少提高了1~2个数量级,检测限达到1.6×10~5 particles/mL。这种高灵敏的ExoAPP技术还可监测药物诱导肿瘤细胞的上皮-间充质转变(EMT)。通过对前列腺癌患者血液样本外泌体表面的PSMA等标志物表达差异分析,ExoAPP可准确鉴别前列腺癌患者和健康人群,进一步证实PSMA等标志物在前列腺癌临床诊断中的潜力。第二部分:基于DNA纳米分子机器的ExoADM技术用于外泌体表面标志物的双色分析和抗PD-1免疫治疗监测受到细胞内高效运行的分子机器的启发,我们将外泌体与核酸适体的多价识别与Toehold介导的链置换循环反应相结合,构建了一种由外泌体激活的具有多价循环放大效应的DNA纳米分子机器(ExoADM),可实现超灵敏的外泌体检测和外泌体表面标志物的双色分析,并可用于抗PD-1免疫治疗监测。ExoADM包含三个核心部件:可对外泌体表面标志物产生响应的识别探针、包含两个Toehold区域的信号探针以及可驱动链置换反应循环进行的燃料探针。外泌体通过其表面标志物与识别探针中的特异适体发生多价结合,释放识别探针中的引发链;引发链侵入信号探针,通过结合Toehold区域Ⅰ,驱动链的分支迁移释放出猝灭链,解放荧光报告基团,并暴露出隐藏的Toehold区域Ⅱ;燃料探针通过结合Toehold区域Ⅱ,启动Toehold介导的链置换循环反应,发生连续的分支迁移和多价回收。基于信号探针中的荧光信号转导机制,单个分子识别事件可引发ExoADM连续释放大量荧光报告基团,实现信号放大,为外泌体分析提供了一个超灵敏(3.3×10~4 particles/mL)、高特异的无酶催化生物传感平台。此外,两种靶向不同外泌体表面标志物的ExoADM可以协同运行,实现外泌体的双色表型分析。利用双色策略,我们可以同时追踪由IFN-γ和白藜芦醇分别诱导PC-3细胞引起的外泌体PD-L1和外泌体CD63表达的动态变化。我们还发现PD-L1和CD63在循环外泌体上的表达水平可以很好地区分肿瘤患者与健康人群。更重要的是,循环外泌体PD-L1水平可以反映肿瘤患者对不同治疗措施(如放疗、化疗和抗PD-1免疫治疗)的治疗反应,有助于指导抗PD-1免疫治疗,并揭示外泌体PD-L1在临床诊断和治疗监测方面的潜力。第三部分:基于DNA纳米分子机器的ExoADM技术监测中药活性成分调控肿瘤细胞外泌体及外泌体PD-L1的研究在上述工作基础上,选取四种中药活性成分:白藜芦醇、紫草素、桔梗皂苷D和紫杉醇,分别作用于非小细胞肺癌A549细胞。在分析了这四种药物对A549细胞增殖和凋亡的影响的基础上,采用ExoADM监测了中药活性成分对肿瘤细胞外泌体释放及外泌体PD-L1的调控。首先采用CCK-8法、流式细胞术和Western blotting技术分析了四种中药活性成分对非小细胞肺癌A549细胞的细胞增殖和凋亡的影响。结果表明,四种药物在一定浓度范围内能够抑制A549细胞增殖,且呈时间浓度依赖性;流式凋亡检测和凋亡相关蛋白的免疫印迹分析证实四种药物有诱导A549细胞凋亡的作用。接下来从四种药物分别处理A549细胞48 h后的细胞上清中分离提取外泌体,并采用ExoADM技术检测外泌体CD63和PD-L1水平。结果表明,这些药物在抑制肿瘤细胞增殖促进其凋亡的同时,也影响了细胞内外泌体合成、内容物装配和转运释放等相关的信号路径,可诱导或抑制外泌体的胞外释放及影响外泌体携带的生物信息分子的表达。在选用的四种中药活性成分中,除了紫草素可以轻度抑制A549细胞的外泌体释放,其他三种均表现出对外泌体释放的诱导增强作用。与此同时,这四种药物均不同程度地促进了外泌体PD-L1的表达。我们用NTA法、BCA法和Western blotting技术进一步验证了我们的实验结果。这提示我们,当这四种中药活性成分被用于临床非小细胞肺癌治疗时,在抑制原发肿瘤病灶细胞增殖的同时,可能会通过上调外泌体PD-L1水平来激活外泌体介导的PD-L1/PD-1路径,促进肿瘤发生免疫逃逸和转移;也有可能通过上调肿瘤的PD-L1水平来提高免疫抑制剂治疗的敏感性,这提示我们联合应用中药活性成分治疗将成为肿瘤免疫治疗的一个重要发展方向。我们的实验结论进一步证实了中药对肿瘤细胞增殖的抑制效应,同时也揭示了中药对肿瘤外泌体及其携带的信号分子调控的复杂性,体现了中药对肿瘤的多靶点、多效应、多环节的调控特点。结论1.发展了一种基于核酸适体纳米探针的ExoAPP技术,实现了肿瘤外泌体的高灵敏定量检测和外泌体蛋白达谱分析,为基于外泌体的肿瘤液体活检提供了一种简单、快速、可靠的生物传感平台。2.发展了一种基于DNA纳米分子机器的ExoADM技术,实现了无酶催化的超灵敏外泌体检测和外泌体双色表型分析,并将其应用于肿瘤免疫治疗(抗PD-1)的监测。3.白藜芦醇、紫草素、桔梗皂苷D和紫杉醇对A549细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。4.采用ExoADM技术监测了中药活性成分对肿瘤细胞外泌体及外泌体PD-L1的调控。紫草素可以抑制A549细胞外泌体的释放,白藜芦醇、桔梗皂苷D和紫杉醇均可诱导A549细胞外泌体释放;四种中药活性成分均不同程度地促进A549细胞外泌体PD-L1的表达。