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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是严重影响全球养猪业的重要病原之一。近来年,PRRSV的非结构蛋白(nsp)在其基因组转录、复制调控和拮抗机体的天然免疫应答中的作用受到广泛关注。本研究分析了 PRRSVnsp11对宿主细胞蛋白p21的降解作用及其生物学意义,探讨了病毒的nsp9和nsp2与宿主细胞的白细胞介素增强子结合因子2 (ILF2)的相互作用及其对病毒复制的调控效应,以期揭示nsp11、nsp9和nsp2在PRRSV复制过程中的作用,为理解PRRSV复制调控的分子机制提供科学依据。采用Western Blot分析了 PRRSV感染MARC-145细胞中p21蛋白的变化。结果显示,PRRSV感染呈剂量依赖性下调MARC-145细胞中p21蛋白水平。流式细胞术分析表明,PRRSV 可通过下调p21蛋白而促进细胞进入S期。分别用血清饥饿、胸苷双阻断和诺苯达唑处理,将MARC-145细胞同步化至G0/G1、S和G2/M期后接种PRRSV,测定病毒滴度。结果显示,同步化至S期的细胞有利于PRRSV复制。进一步采用CRISPR/Cas9系统证实敲除MARC-145细胞p21基因有利于病毒复制。将表达PRRSV各个非结构蛋白和结构蛋白的质粒与表达p21的质粒共同转染HEK 293FT细胞,进行Western Blot分析。结果显示,nsp11可明显下调p21蛋白。构建失活核酸内切酶活性和去泛素化酶活性的nsp11突变体,与表达p21的质粒共同转染HEK293FT细胞。结果表明,nsp11的核酸内切酶活性对其下调p21蛋白至关重要。Real-time PCR分析表明,PRRSV感染和表达nsp11的质粒转染细胞后,p21mRNA水平均无明显变化。降解试验显示nsp11通过蛋白酶体途径降解p21,泛素化分析证实nsp11通过非泛素依赖的蛋白酶体途径降解p21。以上结果表明,PRRSV利用其nsp11的核酸内切酶活性下调细胞p21蛋白,促进细胞进入S期,从而利于病毒自身复制。利用慢病毒表达系统结合免疫沉淀技术及质谱分析,筛选出52个与PRRSV nsp9相互作用的细胞蛋白,选取ILF2进行下一步研究。将表达ILF2的质粒和表达nsp9或nsp2的质粒共同转染HEK 293FT细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)证实外源ILF2与nsp9和nsp2均存在相互作用。进一步在过表达nsp9或PRRSVJXwn06感染的MARC-145细胞中证实内源性ILF2与nsp9或nsp2存在相互作用。利用Co-IP证实nsp9的RdRp结构域与ILF2相互作用,而nsp2的不同截短体均与ILF2相互作用。此外,PRRSV感染可使MARC-145细胞和PAMs中的部分ILF2从细胞核移位至细胞质,与nsp9和nsp2共定位。在MARC-145细胞中,利用siRNA敲低和慢病毒过表达试验证实ILF2可负调控PRRSV复制。以上结果表明,细胞蛋白ILF2与PRRSVnsp9和nsp2均存在相互作用,且这种相互作用不利于病毒自身复制。综上所述,PRRSV利用其nsp11的核酸内切酶活性通过非泛素依赖的蛋白酶体途径降解细胞内p21蛋白水平,促进细胞进入S期,从而有利于病毒复制。细胞蛋白ILF2与PRRSV的nsp9和nsp2存在相互作用,且ILF2对病毒复制具有负调控效应。以上结果有助于进一步理解PRRSV与细胞间的相互作用及nsp 11、nsp9和nsp2在PRRSV复制过程中的作用,为阐明PRRSV复制调控的分子机制提供了科学依据。