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CD47是一种在肿瘤细胞表面高表达的膜蛋白,其能与巨噬细胞表面的CD47的受体--信号调节蛋白α(Signal Regulatory Proteinα,SIRPα)结合,释放“不吃我”信号,抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用,导致肿瘤细胞免疫逃逸。有研究表明,活化的T淋巴细胞中膜蛋白CD47高表达,其通过与血小板反应蛋白1(Thrombospondin-1,TSP1)结合,抑制T淋巴细胞的增殖与活化,进而影响T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。因此,封闭细胞表面的CD47将有助于维持巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬以及T淋巴细胞的增殖与活化。在本课题中,我们将来自于SIRPα突变株CV1、具有高亲和力结合CD47的肽段与人类Ig G1的Fc段融合,构建成SIRPα-Fc融合蛋白(以下简称SF);并通过腺病毒纤毛的改造与启动子的筛选,建立T细胞内的外源基因高效表达系统,构建高效表达SF融合基因的重组腺病毒Ad35-SF。应用Ad35-SF感染T淋巴细胞,表达并分泌SF蛋白从而封闭细胞表面的CD47,探寻当T细胞膜蛋白CD47被封闭之后,T细胞增殖特性、体外杀伤肝癌细胞活性的变化。主要方法及结果如下:(1)T细胞内高效表达系统的筛选与构建通过双荧光素酶报告系统检测方法检测筛选出启动子TCEF1α(in)在Jurkat T细胞中启动活性最高;通过免疫荧光技术以及流式细胞术检测不同纤毛类型的腺病毒对T细胞的感染效率得出,35型腺病毒感染Jurkat T细胞的能力优于5型腺病毒。(2)重组腺病毒载体Ad35-SF的构建与鉴定利用分子克隆技术构建了Ad35-SF,通过PCR对其进行鉴定,挑选包含目的基因并且几乎不含有野生型腺病毒的克隆;通过Western Blot以及ELISA检测发现Ad35-SF能够有效的感染HEK293细胞并表达目的蛋白SF。(3)病毒Ad35-SF感染Jurkat细胞及CIK细胞后对T细胞体外功能的影响Western Blot结果表明:Ad35-SF能够感染Jurkat以及CIK细胞并分泌SF蛋白。ELISA实验证实Ad35-SF感染Jurkat细胞48小时后上清中SF的表达量可到达19.1μg/ml;通过流式检测发现,Ad35-SF(MOI=1)感染Jurkat细胞18小时后,细胞CD47阳性比例从97.06%下降到15.32%;当Ad35-SF感染复数增加至5,10时,CD47阳性比率分别将至2.94%和1.73%。对CIK细胞表面CD47的封闭效果类似,Ad35-SF(MOI=5)感染48小时后,细胞CD47阳性比例从71.87%下降到9.3%。通过CCK8方法检测Jurkat细胞的增殖以及对肿瘤细胞的杀伤作用,结果表明:相较于空病毒对照组,Ad35-SF感染Jurkat细胞后,48 h后Jurkat细胞增殖效果提高了29%(p<0.01)。感染Ad35-SF的Jurkat的细胞对肝癌细胞株Hep3B的杀伤作用提升25.6%(p<0.01)。以上结果表明,构建的重组腺病毒Ad35-SF能有效感染Jurkat细胞及CIK细胞并在其内表达分泌融合蛋白SF,封闭细胞表面的CD47分子,从而有效提高T细胞的增殖能力和对肝癌细胞Hep3B的杀伤作用。