流感嗜血杆菌的耐药性及同源性研究

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背景流感嗜血杆菌是呼吸道的定植菌。近年来由于抗菌药物的广泛使用,流感嗜血杆菌作为条件致病菌引起的感染率持续增加,特别是在有病毒感染、外界侵入性操作、使用免疫抑制剂等造成机体免疫力低下的老年人和儿童中易于引起严重感染,如脑膜炎、菌血症、社区获得性肺炎、急性中耳炎、急性鼻窦炎等。在社区获得性肺炎中流感嗜血杆菌是仅次于肺炎链球菌的常见病原菌。氨苄西林和环丙沙星是呼吸道感染的最常用的经验药物。世界各地对流感嗜血杆菌的耐药监测中,氨苄西林和复方新诺明耐药率不断上升,且地区差异较大。β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药流感嗜血杆菌的检出率也在上升。近年国内也有对喹诺酮耐药流感嗜血杆菌的报道,已引起人们的广泛重视。目前,流感嗜血杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制主要有:产生β-内酰胺酶。常见的β-内酰胺酶有TEM-1和ROB-1型,其中最常见的是TEM-1型。青霉素结合蛋白改变是β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药的机制。流感嗜血杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制主要是喹诺酮耐药决定区的突变导致细菌耐药。Gyr基因编码的DNA促旋转酶和par基因编码的Ⅳ型拓扑异构酶是氟喹诺酮类药物作用的靶位,在核酸复制和转录过程中起非常重要的作用。该区域基因的突变抑制了细菌的DNA复制过程,导致细菌死亡。分子生物学分型有肠杆菌科基因间重复序列(ERIC-PCR)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)等多种方法,通过分析细菌基因组DNA,从遗传进化的角度鉴定菌株的同源性。PFGE具有分辨率强、重复性高等优点,是分子生物分型的金标准,对于病原菌监测、追踪传染源、找寻传播途径等有着非常重要的意义,是监测、控制细菌的传播流行的理想工具。目的了解本地区流感嗜血杆菌的分布及耐药情况,了解流感嗜血杆菌对临床常用抗菌药物的耐药基因型及分子流行病学规律,为临床抗感染治疗提供依据,指导临床合理用药。方法采用k-B纸片法进行药物敏感试验,结果判断参照2010年临床实验室标准化协会(CLSI20)标准。头孢硝噻吩玻片法测定β-内酰胺酶。采用PCR扩增TEM及ROB型β-内酰胺酶基因和喹诺酮耐药决定区基因gyrA、gyrB、parC、和parE及4种质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrA、qnrB、qnrS和aac(6’)-Ib-cr。脉冲场凝胶电泳分析菌株同源性。应用WHONET5.4软件分析52株流感嗜血杆菌的分布情况和药敏结果。结果从2010年1月到2011年7月,共检出52株流感嗜血杆菌,其中42株来自临床送检呼吸道标本,10株来自门诊患者。年龄39~85(66±4.9)岁。临床分离流感嗜血杆菌科室分布以呼吸内科为主28例(53.85%),门诊10例(19.23%),其他科室14例(26.92%)。流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药率19.23%,对复方新诺明的耐药率为65.38%,氨曲南和阿莫西林/克拉维酸钾耐药率11.54%。对二、三、四代头孢、氨苄西林/舒巴坦、阿奇霉素、氯霉毒敏感率在90%以上,亚胺培南和哌拉西林/三唑巴坦敏感率100%。10株氨苄西林耐药菌株均产β-内酰胺酶,产酶率为19.23%。PCR基因扩增及测序结果:10株产酶株均扩增出TEM基因,与GenBank进行Blast比对皆为TEM-1型。10株产酶株均未扩增出ROB基因。收集到2株流感嗜血杆菌对环丙沙星耐药,均扩增出gyrA、gyrB、parC和parE基因产物,未扩增出质粒介导的耐药基因qnrA、qnrB、qnrS和aac(6’)-Ib-cr。2株环丙沙星耐药株同时产生gyrA基因84位丝氨酸突变为苯丙氨酸和88位天冬氨酸突变为酪氨酸和1株parC基因84位丝氨酸突变为异亮氨酸,1株parC基因未发生突变。52株流感嗜血杆菌经脉冲场凝胶电泳后得到51种带型,其中有2株仅有一条带的差别。结论本地区流感嗜血杆菌除对氨苄西林和复方新诺明耐药率较高以外,对其余临床常用的抗生素仍保持较好的敏感性。流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药机制为产TEM-1型β-内酰胺酶。本地区流感嗜血杆菌对喹诺酮耐药可能与gyrA和parC基因突变有关。脉冲场凝胶电泳图谱分析表明,本地区菌株来源分散,同源性差,克隆传播可能性小。
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