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研究背景急性心肌梗死是冠状动脉阻塞导致该冠脉所供血区域心肌细胞坏死所致的一种临床症候群。心肌缺血/再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，I/RI）是急性心梗患者溶栓和介入等血管再通治疗过程中常常伴随出现的重要临床现象，可导致患者病情恶化甚至死亡，因此如何抑制或减轻闭塞冠脉再通时伴随出现的再灌注损伤，寻求一种积极、有效地保护性治疗措施具有重要意义。有研究证实，在缺血/再灌注损伤早期，心肌微血管内皮细胞的凋亡时间明显早于心肌细胞，提示心肌微血管内皮细胞的凋亡是缺血/再灌注损伤发生的始动环节[1]。胰岛素作为极化液的重要组成部分用于治疗冠心病已有较长一段时间，既往研究表明，胰岛素可通过“Akt/eNOS/NO细胞生存信号机制”抑制I/RI诱导的心肌细胞或血管内皮细胞凋亡，发挥心脏保护作用[2,3]，然而其是否能抑制I/RI诱导的心肌微血管内皮细胞凋亡及其相关机制少有报道。FoxO1、FoxO3a是近年发现的FoxO家族中的亚族，参与体内多种病理生理过程，包括调节细胞代谢、调控细胞周期及凋亡等。“其主要定位在细胞核内，通过促进下游靶基因的表达导致细胞凋亡，而其磷酸化后则进入细胞质，失去促凋亡的活性”[4,5]，胰岛素可调控FoxO家族中的部分分子，但在CMECs中是否能够激活FoxO以及是哪个亚类分子在起作用尚不明确。生存素(survivin，SVV)是近期发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族新成员，初步的研究多关注于其对肿瘤诊断、治疗方面的作用，随着研究的不断深入，有学者发现它在心血管疾病的发生发展中也扮演重要角色，包括对损伤血管的修复、平滑肌细胞增殖调控等，我们在前期研究中已证实胰岛素通过上调生存素表达，不仅可抑制I/RI诱导的心肌细胞凋亡，并且对有显著组织特异性的心肌微血管内皮细胞也有保护作用，且其发挥保护作用可能与SVV蛋白表达上调有关[6]，但其相关分子机制是否与FoxO1/3a相关仍不明确。本实验通过构建CMECs的缺血/再灌注模型，观察胰岛素是否通过激活Akt/FoxO1或FoxO3a/SVV信号通路抑制I/RI诱导的CMECs凋亡。研究目的1.观察胰岛素在抑制缺血/再灌注（I/R）损伤诱导的心肌微血管内皮细胞(CMECs）凋亡中的保护作用。2．探讨胰岛素保护CMECs作用是否与Akt/FoxO1或FoxO3a/SVV信号通路有关。实验方法通过培养原代大鼠心肌微血管内皮细胞并构建模拟缺血/再灌注模型。随机分为：1)模拟缺血/再灌注组(SI/R)；2）模拟缺血/再灌注+胰岛素组(SI/R+Ins组)；3)模拟缺血/再灌注+胰岛素+Wortmannin组(SI/R+Ins+Wort组)；4)模拟缺血/再灌注+胰岛素+FoxO1siRNA组(SI/R+Ins+FoxO1siRNA组)；5）模拟缺血/再灌注+胰岛素+FoxO3a siRNA组(SI/R+Ins+FoxO3a siRNA组)。各组分别选用胰岛素、PI3K特异性抑制剂Wortmannin以及FoxO1/3a小干扰RNA处理细胞。采用Western blot法检测p-Akt(ser473)、p-FoxO1(ser256)、p-FoxO3a(Thr32)磷酸化水平及SVV蛋白的表达，TUNEL法检测CMECs凋亡；ELISA法检测Caspase-3活性，Transwell检测细胞迁移能力。实验结果1.分离培养心肌微血管内皮细胞并成功构建了模拟缺血/再灌注模型。2.Transwell结果提示与SI/R组比较，SI/R+Ins组细胞迁移较多(P <0.05)；与SI/R+Ins组相比较，SI/R+Ins+FoxO1siRNA组、SI/R+Ins+FoxO3a siRNA组细胞迁移明显减少(P <0.05)；Caspase-3活性及TUNEL检测结果提示，与SI/R组相比较SI/R+Ins组细胞Caspase-3活性降低，细胞凋亡减少(P <0.05)；与SI/R+Ins组比较SI/R+Ins+FoxO1siRNA组、SI/R+Ins+FoxO3a siRNA组Caspase-3活性增加，细胞凋亡明显增多(P <0.05)；3.Western-blot结果提示与SI/R组比较，胰岛素可显著上调CMECs的SVV蛋白表达（P<0.05）；与SI/R+Ins组相比较，再灌注加入PI3K特异性抑制剂Wortmannin后，SVV蛋白表达下降（P<0.05），当分别加入FoxO1/3a小干扰RNA后， SVV蛋白表达下降，且FoxO3a siRNA组的SVV蛋白表达水平明显低于FoxO1siRNA组（P<0.05）。结论胰岛素可显著抑制缺血/再灌注损伤诱导的CMECs凋亡，其机制与激活Akt/FoxO1/SVV和Akt/FoxO3a/SVV信号通路相关，且主要通过FoxO3a磷酸化上调SVV表达，从而抑制CMECs凋亡。