背景:主动脉夹层(aortic dissection,AD)是心血管疾病中较为凶险的一种疾病,其发病急进展快,一经发现需要立即给予医疗处理,否则会出现致命性风险。AD的主要发病原因是血液由血管的内膜破口进入血管中层,在血压的驱动下在血管夹层中向前流动从而撕裂血管。临床常见的症状为突发的前胸及后背部剧烈的疼痛。主动脉夹层常见的发病因素包括遗传性因素如马凡综合症,Ehlers-Danlos综合症,和非遗传性因素如主动脉中层囊性坏死、高血压、动脉粥样硬化、梅毒性大动脉炎、创伤性动脉瘤等,其中高血压被认为是最主要的诱发因素。目前关于主动脉夹层的具体发病机制尚无明确定论,主要认为和血管中层平滑肌细胞增殖和凋亡失衡有关。已有研究表明,主动脉夹层组织中血管平滑肌的增殖程度明显高于正常人的升主动脉组织,并通过一系列体内和体外实验验证编码平滑肌细胞收缩的标志蛋白增高/减低对主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响。当前这一灾难性疾病尚缺乏早期有效的诊断措施,特别是血清学诊断标志物,目前尚无集特异性和敏感性一体的AD血清诊疗标志物。大部分AD患者仍是通过发病后行主动脉血管造影来明确诊断。但因临床以胸背部疼痛为首发症状的疾病较多,其中心肌梗死是首要怀疑对象。患者多是经过冠脉造影检查无明显异常后才会怀疑AD,进而行主动脉造影检查。其中部分患者在频繁的转运及检查过程中出现夹层破裂死亡。因此更加快速、有效、简便的诊疗方法亟待解决目前AD的诊疗现状。长链非编码RNA(lncRNA)是一类线性非编码RNA。现有研究表明lncRNA能够与微小RNA结合进而影响编码基因的表达,从而影响疾病的发展。在心血管疾病中,目前已经有许多报道lncRNA和心衰、缺血性心脏病、心脏瓣膜病发病过程相关,但是在AD的发病过程中的研究较少,尤其是lncRNA对AD血管中层平滑肌细胞收缩过程的影响尚无具体的机制研究报道。目的:本研究通过高通量芯片二代测序技术检测了AD患者升主动脉内膜破口组织和对照组非夹层患者升主动脉组织中lncRNA,miRNA和mRNA基因表达谱,通过现代高通量生物信息学分析二代测序结果,找到差异表达的lncRNA,miRNA和mRNA,并对差异表达的基因进行基因本体分析和信号通路分析。试图筛选出在AD发病过程中血管中层平滑肌细胞收缩的关键lncRNA-miRNA-mRNA信号通路。并通过细胞学实验验证,最终提出AD发病的关键机制以及未来早期诊断所需的血清学标志物和潜在药物治疗靶点。方法:1.升主动脉组织标本的搜集。将确诊的非遗传性主动脉夹层患者手术切除的位于破口周围的升主动脉组织(实验组)和冠状动脉旁路移植术患者手术中经打孔器取下的升主动脉组织(对照组)进行清洗,保存于-80℃液氮中。2.AD疾病中lncRNA,miRNA和mRNA基因表达谱检测。随机选取6例AD患者破口周围升主动脉组织和6例缺血性心脏病患者升主动脉组织,进行高通量二代芯片测序,按照p<0.05,差异表达倍数≥2的选择标准初步筛选出有意义的差异表达lncRNA,miRNA和mRNA。同时随机选取10例AD升主动脉组织和10例缺血性心脏病患者升主动脉组织进行实时定量PCR验证基因芯片的准确性。3.AD升主动脉组织中差异表达lncRNA,miRNA和mRNA的生物信息学分析。将AD组织中差异表达的mRNA和GEO数据库中主动脉夹层mRNA基因测序结果GSE52093进行融合后,通过基因本体分析,KEGG信号通路分析,筛选出目标mRNA,利用targetscan及DIANA tools进行lncRNA和miRNA预测,利用的韦恩分析确立最终lncRNA,miRNA,并讨论目标lncRNA,miRNA和mRNA与血管平滑肌增殖以及迁移能力关系,最终确立lncRNA-miRNA-mRNA发病通路4.linc01278在AD升主动脉平滑肌细胞增殖及迁移过程的作用机制研究。原位杂交实验检测linc01278在血管平滑肌细胞中的具体细胞定位。质粒过表达linc01278和RNA干扰linc01278后,检测:1)linc01278、miR-500b-5p、ACTG2表达量变化;2)增殖型血管平滑肌细胞诱导后,检测平滑肌收缩标记基因SMA,SM22α,MYH11,calponin的表达量;3)CCK-8实验检测转染后血管平滑肌细胞增殖状态。4)检测MMP2和MMP9以及划痕实验验证转染后血管平滑肌细胞迁移状态。5.双荧光素酶报告基因实验。通过targetscan及DIANA tools数据库对linc01278与miR-500b-5p结合位点以及miR-500b-5p和ACTG2结合位点的预测,通过双荧光素酶实验进一步验证miR-500b-5p与linc01278和ACTG2的结合位点。结果:1.成功获取人主动脉夹层升主动脉组织及缺血性心脏病患者升主动脉组织,并进行RNA提取,浓度、纯度的检测,符合进一步实验标准。2.高通量二代芯片测序检测出主动脉夹层破口周围升主动脉组织中差异表达lncRNA及mRNA。lncRNA基因表达芯片显示共有2084个差异表达的lncRNA,其中有730个差异上调表达的基因,1354个差异下调表达的基因;mRNA基因表达芯片显示共有2834个差异表达的mRNA,其中有1928个差异上调表达的基因,906个差异下调表达的基因。随机选取5个上调及5个下调差异表达lncRNA和5个上调及5个下调差异表达mRNA通过qRT-PCR在10例主动脉夹层组织和10例缺血性心脏病升主动脉组织中的表达量,qRT-PCR表达结果和基因芯片表达结果趋势相同,证明芯片结果准确可靠。3.构建了ceRNA调控网络,将mRNA芯片与GEO数据库的人主动脉夹层基因芯片GSE52093进行交叉融合分析。所得到的144个共同差异上调表达的基因和96个共同差异下调表达的基因。对全部差异表达基因进行信号通路分析,下调的差异基因富集在血管平滑肌收缩通路,上调的差异基因富集在细胞周期通路。对下调的全部差异基因进行蛋白质互作网络分析和cytohubba生物信息学计算出ACTG2,BDNF,DMD,CNN1,MYOCD为主动脉夹层发病的核心基因。将上述核心发病基因通过targetscan生物信息软件预测出与之有结合位点的miRNA,将预测的214个miRNA和我们的miRNA基因芯片进行韦恩分析,得到13个共同表达的miRNA。利用DIANA tools对13个miRNA进行预测与之有结合位点的lncRNA,将所预测的lncRNA和我们的lncRNA基因芯片进行融合分析,最终得到6个共同差异表达的lncRNA。从而构建出ceRNA调控网络。根据现代高通量生物信息学计算方法,我们最终预测出linc01278(下调表达)—miR-500b-5p—ACTG2(下调表达)调控通路在主动脉夹层患者升主动脉平滑肌增殖和迁移过程中发挥重要调控作用。4.linc01278调控主动脉夹层升主动脉平滑肌细胞表型转化功能的验证。利用RNA干扰技术敲低血管平滑肌细胞中的linc01278发现,随着linc01278表达量降低后,miR-500b-5p的表达反而增高,使得其对下游调控的靶mRNA ACTG2的抑制增加从而使其表达量下降,而ACTG2是血管平滑肌收缩通路中的重要因子,通过对血管平滑肌细胞增殖及表型转化基因标志物的检测,最终结果示:SMA,SM22α,MYH11,calponin同时呈现下降趋势,说明血管平滑肌增殖能力增强。上述现象可以通过miR-500b-5p inhibitor补救实现逆转,使得血管平滑肌增殖能力减弱。而通过质粒在linc01278过表达细胞实验中,出现和RNA干扰相反的结果,当linc01278表达量增加以后,血管平滑肌增殖能力减弱。上述现象可以通过miR-500b-5p mimics补救实现逆转。5.双荧光素酶报告实验验证linc01278,miR-500b-5p和ACTG2的可结合性。分别构建pGL6-miR-linc01278(WT),pGL6-miR-ACTG2-3’UTR(WT)和miR-500b-5p mimics后,通过转染293T细胞并进行荧光量检测发现野生型的发光信号明显降低,说明结合位点结合抑制发光从而证明miR-500b-5p与linc01278和ACTG2之间的可结合性。结论:1.主动面夹层基因芯片结果显示主动脉夹层患者升主动脉组织中较非主动脉夹层升主动脉组织中有2084个差异表达的lncRNA和2834个差异表达的mRNA。2.通过对lncRNA,miRNA和mRNA基因表达谱中差异基因的高通量生物信息学分析发现,linc01278可能通过竞争性结合miR-500b-5p从而调控ACTG2的表达,进而影响血管平滑肌收缩通路造成血管平滑肌细胞异常增殖和表型转化。3.敲低linc01278后血管平滑肌细胞增殖和迁移能力增强;过表达linc01278后血管平滑肌细胞增殖和迁移能力减弱。4.双荧光素酶报告实验证实miR-500b-5p与linc01278和ACTG2之间的可结合性。综上,主动脉夹层升主动脉平滑肌组织中低表达linc01278通过减少对miR-500b-5p的竞争性吸附,从而抑制了ACTG2的表达,进而促进血管平滑肌细胞收缩,使得血管平滑肌细胞增殖能力和迁移能力增强。上述研究结果为非编码RNA在主动脉夹层发病机制中作用机制及分子通路提供新的理论基础。同时为未来早期诊断所需的血清学标志物以及潜在药物治疗靶点提供研究方向。