论文部分内容阅读
研究背景及目的血液中高游离脂肪酸状态正是糖尿病患者的病理特征之一。棕榈酸(Palmitic acid,PA)是机体内含量最多的饱和脂肪酸,被广泛应用于脂毒性作用的研究。Micro RNAs(mi RNAs)是具有高度保守性的单链非编码小RNA,mi RNAs通过碱基配对原则,靶向目标信使RNA(message RNA,m RNA)从而调节基因表达。近年来研究报道了mi RNAs在调控基因表达以及其在包括糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)在内的各种疾病的发展和进展中的作用。最新的研究报道,mi R-483-5p与糖尿病的发病有关,同时有报道认为mi R-483-5p可能参与缺氧诱导的人心肌细胞凋亡和氧化应激的过程。以上研究结果为本研究探讨mi R-483-5p在糖尿病肾病中对细胞凋亡和氧化应激的作用提供了依据。基于上述依据,本研究采用棕榈酸模拟高脂环境处理小鼠肾足细胞,探讨mi R-483-5p在棕榈酸诱导损伤的足细胞中的作用及潜在机制,为明确脂质肾毒性的机制提供实验依据,为糖尿病肾病的未来新药开发提供一定的理论依据。研究方法1)采用不同浓度的棕榈酸(0、0.05、0.1、0.2、0.5和1 mmol/L)处理小鼠的肾足细胞,检测各组足细胞活力和mi R-483-5p的表达水平;2)mi R-483-5p inhibitor处理小鼠的肾足细胞,按照处理方式不同分为Control组、PA组、(PA+NC)组和(PA+In)组,运用CKK-8(Cell counting kit-8)实验检测mi R-483-5P inhibitor对各组细胞活力的影响;流式细胞术检测对各组凋亡能力的影响;比色法检测mi R-483-5p对棕榈酸处理后的细胞氧化应激指标(包括丙二醛和超氧化物歧化酶)的影响;3)荧光素酶双报告基因验证mi R-483-5p与KLF2之间的关系,将按照处理方式不同分为四组,分别为Blank+KLF2-WT组、mi R-483-5p mimic+KLF2-WT、Blank+KLF2-MT和mi R-483-5p mimic+KLF2-MT组,检查各组荧光素酶的活性。4)按照细胞处理方式不同分为Control组、(PA+NC)组、(PA+M)组和(PA+M+KLF2)组,运用实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Realtime Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)检测各组细胞中mi R-483-5p和KLF2的m RNA的表达水平的变化,CKK-8细胞检测各组细胞活力、比色法检测各组MDA和SOD水平、流式细胞仪检测各组细胞凋亡能力的改变;5)蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测棕榈酸和mi R-483-5p对Cleaved caspase3、Nephrin、Podocin蛋白表达水平和氧化应激指标MDA和SOD的影响。研究结果1)Control组、0.05mmol/L组、0.1mol/L组、0.2 mmol/L组、0.5 mmol/L组和1mmol/L足细胞活力分别为(97.51±10.73)%、(85.61±10.79)%、(74.83±7.89)%、(64.10±7.75)%、(44.60±4.21)%、(23.86±2.69)%,与对照组和0.05mol/L相比,其他各组细胞活力明显降低(F=35.16,P<0.0001),Control组、0.05mmol/L组、0.1mol/L组、0.2 mmol/L组、0.5 mmol/L组和1 mmol/L组足细胞中mi R-483-5p的表达水平分别为(1.14±0.07)、(1.66±0.08)、(2.03±0.18)、(3.05±7.75)、(4.23±0.44)和(6.60±0.54),与Control组和0.05mol/L相比,其他各组细胞中mi R-483-5p水平明显升高(F=114.40,P<0.0001),以上结果显示棕榈酸可显著抑制细胞活力并促进细胞mi R-483-5p的表达,且呈一定的浓度依赖性。当棕榈酸浓度为0.5 mmol/L时,细胞活力降低超过50%,因此选择0.5 mmol/L作为后续实验处理条件。2)Control组、PA组、(PA+NC)组和(PA+In)组mi R-483-5p的表达水平分别为(0.99±0.08)、(4.29±0.49)、(4.33±0.47)和(3.70±0.47),与Control组相比,0.5 mmol/L棕榈酸可明显促进mi R-483-5p表达,而mi R-483-5p inhibitor在一定程度上可逆转棕榈酸对mi R-483-5p表达的促进作用(F=32.90,P<0.0001);各组细胞活力分别为(101.01±14.21)%、(42.34±3.21)%、(43.20±2.84)%和(74.22±8.24)%,结果显示小鼠肾足细胞经0.5 mmol/L棕榈酸处理24 h后,细胞活力显著降低,而mi R-483-5p inhibitor可逆转棕榈酸对细胞活力的抑制作用,部分恢复细胞活力。细胞凋亡实验结果显示各组细胞凋亡率分别为(2.76±0.19)%、(35.44±7.86)%、(34.99±7.64)%、(16.92±2.30)%,与Control组相比,其他各组细胞凋亡率明显升高(F=23.74,P=0.000),结果表明棕榈酸能够显著促进细胞凋亡,而mi R-483-5p inhibitor部分逆转了棕榈酸对细胞凋亡的促进作用。各组细胞中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的表达水平分别为(4.99±0.26)nmol/L、(24.77±3.26)nmol/L、(25.31±3.23)nmol/L、(10.17±1.98)nmol/L,与Control相比,其他各组细胞MDA的表达水平明显升高(F=50.86,P<0.0001),各组超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的表达水平分别为(31.52±3.91)U/mg、(9.04±0.93)U/mg、(9.21±1.21)U/mg、(22.83±2.90)U/mg,与Control相比,其他各组细胞MDA的表达水平明显升高(F=42.96,P<0.0001)结果表明,棕榈酸能够显著促进丙二醛的表达,并抑制超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的表达,而mi R-483-5p inhibitor部分逆转了棕榈酸对细胞MDA和SOD表达的作用。3)mi R-483-5p在KLF2基因的3′-UTR(3’-Untranslated Region)上具有潜在的结合位点,双荧光素酶报告基因实验结果显示,各组荧光素酶的相对活性分别为(0.99±0.16)、(0.26±0.08)、(1.00±0.19)、(0.94±0.13),与Blank+KLF2-WT组相比,mi R-483-5p mimic+KLF2-WT组显著抑制细胞的荧光活性(t=7.324,P=0.002),而Blank+KLF2-MT组与mi R-483-5p mimic+KLF2-MT组相比较,荧光活性无明显差异(t=0.482,P=0.655)。4)Control组、(PA+NC)组、(PA+M)组和(PA+M+KLF2)组细胞中KLF2m RNA的相对表达水平分别为(0.99±0.17)、(0.64±0.08)、(0.61±0.07)和(0.84±0.15),与Control组相比,PA组、(PA+NC)组和(PA+In)组细胞中KLF2 m RNA的表达水平明显降低(F=6.269,P=0.017),q RT-PCR检测KLF2在小鼠肾足细胞中的表达结果显示,棕榈酸组较对照组的KLF2表达明显降低,mi R-483-5p inhibitor部分逆转棕榈酸对细胞中KLF2表达的抑制作用。各组细胞活力分别为(98.67±10.02)%、(45.67±3.06)%、(25.33±1.53)%和(72.67±7.09)%,mi R-483-5p mimic进一步增强棕榈酸对细胞活力的抑制作用,而该增强作用被KLF2过表达部分逆转。5)Control组、(PA+NC)组、(PA+M)组和(PA+M+KLF2)组细胞中MDA的表达水平分别为(5.13±0.39)nmol/L、(25.40±2.24)nmol/L、(38.43±4.02)nmol/L和(20.82±2.69)nmol/L,各组细胞SOD的表达水平分别为(34.16±4.50)U/mg、(9.36±2.42)U/mg、(5.91±1.76)U/mg和(15.68±3.01)U/mg。棕榈酸显著增加了MDA表达水平并抑制SOD表达水平mi R-483-5p mimic进一步增强棕榈酸对MDA和SOD表达水平的调节作用,而该增强作用被KLF2过表达部分逆转。各组细胞中Nephrin和Podocin的表达水平分别为[(0.97±0.09)、(1.75±0.20)、(2.68±0.30)、(1.37±0.22)]、[(0.99±0.06)、(0.56±0.10)、(0.19±0.20)、(0.55±0.12)]和[(1.01±0.05)、(0.26±0.07)、(0.14±4.02)、(0.53±0.09)],mi R-483-5p mimic可增强棕榈酸对MDA、SOD、Cleaved caspase3、Nephrin和Podocin的调节作用,增强作用被KLF2过表达部分逆转。研究结论mi R-483-5p可以通过调节KLF2的表达参与影响棕榈酸诱导的足细胞损伤的过程,该调控机制有助于糖尿病肾病患者预后问题的研究。