目的前期研究证明了α-黑素细胞刺激素(α-MSH)与羧甲基纤维素钠(CMC)联合使用在东莨菪碱诱导的大鼠干眼模型中的保护作用,基于此进一步探究在体外α-MSH联合CMC在高渗环境下是否会对人角膜上皮细胞有联合保护作用并探究其具体的机制。方法1.在DMEM/F12基础培养基中加入不同质量的氯化钠,形成高渗培养基。用冰点渗透压仪检测渗透压,建立氯化钠浓度和渗透压之间的关系,用构建的渗透压模型来培养人角膜上皮细胞,并以CCK-8的结果筛选出最适的造模渗透压。2.筛选α-MSH和CMC的最佳作用浓度后将细胞分为5组:正常渗透压组,高渗组,高渗+CMC组,高渗+α-MSH组,高渗+CMC+α-MSH组。3.高渗处理和药物作用后,检测细胞生物学行为的改变,包括细胞活性,细胞迁移能力,经上皮细胞跨膜电阻(TEER)。4.对高渗处理和药物作用后的人角膜上皮细胞进行具体的机制研究。通过Annexin V试剂盒检测细胞凋亡水平,荧光法检测ROS水平,qPCR检测NLRP3相关基因转录水平,western-blot检测NLRP3相关蛋白水平,以及对Caspase1酶活性进行测定来研究机制。5.运用NLRP3的激动剂LPS和抑制剂MCC950后,检测人角膜上皮细胞在高渗环境中NLRP3的基因转录和蛋白表达水平。结果1.成功建立角膜上皮细胞高渗模型,以角膜上皮细胞的细胞活性为指标,随着渗透压的升高,角膜细胞活性递减,在400,450,500mOsM高渗环境下刺激24小时后,细胞形态还未有明显变化。而在550mOsM高渗环境下刺激24小时,镜下观察发现角膜上皮细胞形态不规则,死细胞增多。分别在400、450、500mOsM和550mOsM的高渗环境下刺激24小时,细胞活性降为295mOsM培养下的(84.99 5.78)%,(78.18 4.79)%,(64.83 4.32)%,(40.52 2.09)%,差异有统计学意义。故选择500mOsM的高渗环境作为后续研究的刺激浓度。2.500mOsM刺激4小时后细胞迁移能力降低;TEER减小,细胞间连接减弱,角膜上皮的屏障功能受损;凋亡细胞数量从28.5%增加到41.67%,ROS水平相比于312mOsM组显著升高,从(4.09 0.11)倍升高到(5.14 0.33)倍;刺激24小时后NLRP3,IL-1 mRNA水平增加到原来的(1.90 0.07)倍,和(1.35 0.13)倍;Caspase1活性升高(1.37 0.04)倍。3.当分别用0.01,0.1,1μM的α-MSH和0.2,0.5,1,2.5 mg/ml的CMC提前30min预作用于细胞,都能使500mOsM刺激24小时后的细胞活性增强,然而,三组不同浓度的α-MSH组之间并没有显著差异,CMC在浓度为0.2和0.5 mg/ml时增强细胞活性最明显,但组间无差异。故选择0.01μM的α-MSH和0.2mg/ml的CMC作为最终药物作用浓度。4.当在500mOsM刺激下单独使用0.01μM的α-MSH和0.2mg/mL的CMC时,能增强高渗组的角膜上皮细胞的迁移能力,增强跨上皮细胞电阻,减少凋亡细胞数量,降低ROS水平,降低NLRP3,IL-1 mRNA转录水平,降低NLRP3,pro-Caspase1的蛋白表达水平,降低Caspase1活性,但联合使用后作用更显著,且于CMC单独作用组比较差异有统计学意义(P<0.05)。5.用LPS和MCC950对高渗组进行激动和拮抗后,再检测NLRP3的转录和翻译水平。LPS+高渗组相比于高渗组,NLRP3的mRNA水平和蛋白表达水平都更高,Caspase1的活性更高,且α-MSH和CMC联合作用后,能使NLRP3的mRNA水平和蛋白水平都降低,并使Caspase1的活性降低。MCC950能抑制高渗下NLRP3的转录,与α-MSH和CMC联合作用的效果相近。结论在高渗环境下,对角膜上皮细胞联合使用CMC和α-MSH能增加细胞活性,促进细胞修复,增加TEER,这些生物学行为的改变与联合使用后能降低细胞在高渗环境下的ROS水平,使NLRP3,IL-1的mRNA水平和蛋白表达水平降低,并且降低Caspase1活性,减少凋亡细胞有关。