B. subtilis的lipA基因编码胞外脂肪酶,是已知最小的纯脂肪酶之一,具有优良的酶学特性,在商业和科研领域有较大的应用前景。本文研究了lipA基因表达元件的基本特性,对于通过基因修饰实现B. subtilis lipA基因高水平表达,构建高产脂肪酶的工程菌株进行了初步的探索。对B. subtilis 168 lipA基因的启动子和mRNA前导区二级结构进行了软件预测,结果显示lipA基因启动子位于结构基因上游-92bp--125bp之间,而不是原来认为的在-33bp--64bp之间。转录起始位点在结构基因上游-85bp处,mRNA前导区为85nt。通过对lipA基因表达元件的分析,推断导致lipA基因低水平表达的主要原因有两个:一是弱启动子降低转录起始效率;二是mRNA二级结构妨碍核糖体对RBS序列的识别,影响翻译效率。为了使lipA基因高水平表达,制定了lipA基因启动子和mRNA前导区修饰方案,即保留原有的启动子,在原有启动子的下游插入一个与共同序列相一致的强启动子,用已知具有稳定子作用的B. subtilis aprE基因的mRNA前导区编码序列替换lipA基因原有的mRNA前导区编码序列,使修饰后的lipA基因具有双启动子,并使mRNA的半衰期延长。本文对实验室保藏的B. subtilis SH-2和DB104菌株lipA结构基因上游区域进行了测序,发现其序列与Gene Bank中B. subtilis 168的序列完全一致。从而确定本研究的出发菌株为B. subtilis DB104,而不使用SH-2菌株。通过重叠PCR法拼接重组片段Lu-e-Ld。用Lu-e-Ld片段对B. subtilis DB104原生质体进行转化,实验结果表明,即使使用高浓度的线性DNA片段也难以获得转化子。推测原因是处于原生质体状态的B. subtilis细胞缺乏进行基因重组的酶和生理条件。用带有EcoRⅠ切点的LE片段与质粒pUC18相连,构建了重组质粒pUC18-LE;用该质粒转化B. subtilis DB104感受态细胞,筛选得到了具有红霉素抗性的lipA基因缺陷型菌株B. subtilis B1。经表型和PCR验证,证明B. subtilis B1的特点符合预期。