背景:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是全球常见的恶性肿瘤,发病率和病死率高,严重影响人类健康与生命。迄今,CRC的临床治疗中尚缺少有效的手段,干预药物的研发依然缺乏有效的靶标。因此,系统揭示CRC的发病机制、寻找药物干预的有效靶标一直是本研究领域亟待解决的热点、难点问题。经典瞬时受体电位通道（transient receptor potential canonical,TRPC）是一类重要的非选择性阳离子通道,可参与调控细胞的增殖、凋亡和迁移等众多与肿瘤相关的生物学过程,但其在结直肠癌发生发展中的作用及机制尚未系统阐明。迷迭香酸（rosmarinic acid,RA）是一类天然化合物,在体内外均有较明显的抗结直肠癌作用,但其作用机制尚未完全阐明。本课题组前期研究发现,迷迭香酸与TRPC1蛋白具有较好的空间结合构象,并能抑制心肌细胞中TRPC1介导的钙内流,提示TRPC1作为重要靶点参与迷迭香酸抗结直肠癌作用的可能性。目的:研究TRPCs在CRC发生发展中的作用及机制,寻找结直肠癌药物治疗潜在新靶点。评价迷迭香酸靶向TRPC1发挥抗结直肠癌的作用,为迷迭香酸的抗癌应用提供新的理论和实验基础。方法:1.体外实验方法使用GENT2数据集分析TRPCs在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达差异。采用CRC患者组织芯片和结直肠癌细胞系确证TRPC1的差异表达。应用TCGA数据库和CRC患者组织芯片分析TRPC1表达水平与疾病进展和患者预后的相关性。构建TRPC1沉默/过表达的结直肠癌细胞,采用MTT、细胞克隆形成实验、流式细胞术和transwell实验等分别检测TRPC1沉默/过表达对CRC细胞增殖、周期、侵袭和迁移的影响。采用STRING蛋白互作分析、Western blot、双波长离子影像实验和抑制剂干预的策略研究TRPC1调控CRC发生发展的分子机制。采用MST实验测定迷迭香酸与TRPC1蛋白之间的亲和力。采用CCK-8、细胞克隆形成、transwell、Western blot和双波长离子影像实验研究迷迭香酸靶向TRPC1发挥抗结直肠癌的作用。2.体内实验方法采用裸鼠皮下荷瘤模型研究TRPC1沉默/过表达对肿瘤生长的影响。采用裸鼠尾静脉转移瘤模型研究TRPC1过表达对肿瘤肺转移的影响。采用Trpc1-/-小鼠研究TRPC1促进结直肠肿瘤形成的作用。结果:1.TRPC1在结直肠癌组织中表达显著上调,并与结直肠癌疾病进展正相关,与患者预后负相关（1）GENT2数据集分析结果显示,与癌旁正常组织（n=287）相比,TRPC家族中的TRPC1在结直肠癌组织（n=1994）中表达上调,而其余亚型无显著性差异。（2）人结直肠癌患者组织芯片分析结果显示,与癌旁组织（n=13）相比,TRPC1在结直肠癌组织（n=98）中显著高表达（1.26-fold）;Western blot结果显示,与NCM460细胞相比,TRPC1表达水平在4株结直肠癌细胞系中均显著上调。（3）TCGA数据库和CRC患者组织芯片生物信息学分析结果表明,TRPC1表达水平与结直肠肿瘤组织学分级、转移呈正相关,与患者的总生存率（P＜0.001）和无病生存率（P=0.0397）呈负相关。2.TRPC1促进结直肠癌形成、增殖和转移,在结直肠癌进程中起关键调控作用（1）成功构建稳定沉默TRPC1的HCT116和SW620细胞系,稳定过表达TRPC1的HT29和SW620细胞系。（2）沉默TRPC1抑制了HCT116和SW620细胞的增殖（62.9%of Control）,阻滞细胞周期在G2/M期,下调了细胞周期相关蛋白CDK1和Cyclin B1的表达水平;同时降低裸鼠皮下瘤的重量和体积（抑制率77.2%）,肿瘤组织中Ki-67的表达水平也显著降低。过表达TRPC1促进了HT29和SW620细胞的增殖（152.8%of Control）,升高裸鼠皮下瘤的重量和体积,肿瘤组织中Ki-67的表达水平也显著升高。（3）沉默TRPC1抑制了HCT116和SW620细胞的侵袭和迁移能力,上调上皮性标志蛋白E-cadherin的表达,下调间质性标志蛋白N-cadherin、Snail1和Slug的表达。过表达TRPC1促进了HT29和SW620细胞的侵袭和迁移能力,EMT相关分子的蛋白水平也出现一致性变化;并能显著增加裸鼠尾静脉转移模型中肺部肿瘤转移结节的数量。（4）Trpc1基因敲除显著抑制小鼠结直肠肿瘤形成。与WT小鼠相比,AOM/DSS模型小鼠肿瘤数量（9.2-fold）和结直肠指数（2.9-fold）均显著增加;与AOM/DSS模型小鼠相比,Trpc1-/-造模小鼠的结直肠肿瘤数量（2.6-fold of Control）和结直肠指数（1.2-fold of Control）均显著降低。（5）STRING蛋白互作分析结果提示TRPC1与PI3K/AKT信号通路高度相关;Western blot结果显示,沉默TRPC1降低了PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平,而过表达TRPC1升高了其磷酸化水平;PI3K抑制剂可显著抑制TRPC1过表达引起的CRC细胞增殖、侵袭和迁移。（6）双波长离子影像实验结果显示,结直肠癌细胞中Ca2+内流增加;沉默TRPC1能够显著抑制结直肠癌细胞中的Ca2+内流,反之,过表达TRPC1增加其Ca2+内流。3.迷迭香酸可抑制CRC细胞中TRPC1的表达与活性,进而发挥抗结直肠癌作用（1）MST测定结果显示,迷迭香酸与TRPC1蛋白具有高亲和力（Kd=65μM）,能够相互结合。（2）迷迭香酸浓度依赖性地抑制了SW620和HCT116细胞的增殖（20μM:82.1%of Control;40μM:45.1%of Control;80μM:20.5%of Control）和迁移（20μM:58.7%of Control;40μM:23.4%of Control;80μM:11.6%of Control）。（3）RA可以抑制SW620细胞的SOCE水平,还可降低CRC细胞中TRPC1的蛋白表达水平。（4）平板克隆和transwell实验结果表明,沉默TRPC1和80μM RA干预均可显著抑制SW620和HCT116细胞的增殖、迁移能力,且sh TRPC1+80μM RA组与80μM RA干预组相比无显著性差异,提示迷迭香酸通过调控TRPC1抑制CRC细胞的增殖和迁移。结论:本研究首次证实TRPC1在CRC组织中显著高表达,可通过介导细胞外Ca2+内流,活化PI3K/AKT通路,进而促进结直肠癌细胞的增殖和转移。迷迭香酸与TRPC1具有高亲和力,通过调控TRPC1发挥其抗结直肠癌作用。TRPC1是结直肠癌治疗的潜在新靶点,靶向TRPC1是迷迭香酸发挥抗结直肠癌作用的新途径。