研究背景口腔是微生物在人体上重要的栖息环境,口腔微生物也是人体各种微生物群落中最复杂的一种,由超过700种细菌组成。口腔微生物一旦失衡,不仅影响口腔健康,也影响全身健康。学者们最近提出,一些慢性疾病的病因可能是微生物群落。长期以来,研究微生物主要依赖分离培养法。Staley等认为可分离培养不足1%的微生物,提示以培养法研究口腔微生物的多样性和基因具有严重偏差。1998年,Handelsman首次提出宏基因组学(metagenome),其样品包括可培养和不可培养的微生物。2007年美国国家科学院联合会呼吁建立全球宏基因组学研究计划。目前对于口腔生态系统中微生物群落组成的了解还十分有限,对于健康青年人口腔微生物组成更是知之甚少。DGGE(变性梯度凝胶电泳)是一种基于对PCR产物电泳分析的技术,1779年由Fischer等提出。DGGE最初只是在医学领域中用于分析基因突变,1993年Muyzer等首次将其用于微生物群落分析,此后,关于该项技术在不同的微生态环境研究中的应用报道日益增多。研究目的本研究主要对于不同个体不同时间段的健康青年人口腔唾液微生物采用不同的DNA提取方法进行比较研究,以便在对口腔微生物进行研究时,可根据不同的目的选用更适用的方法,为在分子生物学水平上认识口腔微生物的特点及与疾病间的关系提供基础。本研究将对不同微生物总DNA提取方法对口腔微生物群落DGGE分析结果的影响进行研究,旨在为对口腔环境微生物群落的PCR-DGGE研究提供一种更为优化适合的口腔环境微生物总DNA提取方法,以使其能获得更为丰富的微生物物种信息本研究亦采用PCR结合DGGE的分子手段对不同个体不同时间段的健康青年人口腔唾液微生物群落多样性进行了比较分析。旨在为DGGE应用于健康青年人口腔微生物分子生态分析提供资料。研究内容第一部分健康青年人口腔微生物总DNA提取方法的比较一、方法1、健康青年人口腔唾液样品的采集：依据WHO相应的纳入标准从南方医科大学口腔医学院选取30名口腔健康的学生。对所有受检者进行口腔检查并记录口腔状况。采集样品前30min受检者轻轻漱口,采集自然排出唾液2mL,对同一受检者1h后及1d后再次进行样品采集。2、口腔微生物总DNA的提取：对3个时间段的90例健康青年人口腔唾液样品使用结合预实验进行修改的酚氯仿抽提法和QIAamp DNA Micro Kit法提取口腔微生物总DNA。3、不同方法提取的总DNA的检测：通过目测,琼脂糖电泳,微量分光光度计等检测不同方法提取的不同时间段样品总DNA的片段大小,得率和纯度,及PCR扩增效果等,并加以比较。二、结果1、修改后的酚氯仿抽提法提取的口腔微生物基因组DNA目测部分样品可见少量絮状物；琼脂糖凝胶电泳图显示DNA片段大小为23kb左右,并存在拖尾现象；提取的DNA平均得率为10.03±7.31ng.μl-1；提取的DNA的A260nm/A280mn比值大部分小于1.7；经PCR扩增出的特异性条带不够清晰。2、修改后的QIAamp DNA Micro Kit法提取的口腔微生物基因组DNA目测样品均接近无色；琼脂糖凝胶电泳显示DNA片段大小为23kb左右,虽在泳道中呈现的较为清晰,但仍存在拖尾现象；提取的DNA平均得率为53.49±34.78ng.μl-1；提取的DNA的A260nm/A280nm比值均大于1.7,大部分位于1.7～1.8之间；经PCR可扩增出较为清晰的特异性条带。3、用修改后的酚氯仿抽提法和QIAamp DNA Micro Kit法提取的口腔微生物基因组DNA无论目测,粗提DNA和PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图显示,A260mn/A280nm比值和DNA的得率均见差异(P<0.001)。4、提取的3个时间段的口腔微生物基因组DNA无论目测,粗提DNA和PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图显示,A260nm/A280nm比值和DNA的得率3组间及两两间均未见显著差异(P>0.05)。琼脂糖凝胶电泳显示DNA片段大小均为23kb左右。三、结论1、酚氯仿抽提法和QIAamp DNA Micro Kit法均可提取口腔健康人群的口腔唾液微生物总DNA,且均可应用于PCR扩增,可用于进一步的微生物多样性及宏基因组学研究。2、酚氯仿抽提法费时、复杂,但经济,可同时提取大量样品,较适合用于大量样品的研究。3.QIAamp DNA Micro Kit法成本较高,DNA片段较大,得率纯度较高,较适合用于小样品及分子技术研究如宏基因组学等。4、短时间内的3个时间段同一供体的唾液微生物的总DNA未见明显差异,可将同一供体短时期内不同时间段收集的唾液进行混合使用,以增加微生物含量,提高DNA产率,利于分子技术研究如宏基因组文库构建等。第二部分微生物总DNA提取方法对口腔微生物群落多样性分析的影响研究一、方法1、健康青年人口腔唾液样品的采集：依据相应的纳入标准从南方医科大学口腔医学院选取8名口腔健康的学生。每次采集样品前均对所有受检者进行口腔检查并记录口腔状况。采集样品前30min受检者轻轻漱口,采集自然排出唾液2mL,平均分为两份。2、口腔微生物总DNA的提取：对2组的16例健康青年人口腔唾液样品使用结合第一部分实验结果进行修改的酚氯仿抽提法和QIAamp DNA Micro Kit法提取口腔微生物总DNA。3、口腔微生物16SrDNA基因的PCR-DGGE:对所提取的健康青年人口腔微生物总DNA采用口腔微生物的16S rDNA通用引物的PCR扩增按Viadimir等的方法进行。PCR后产物经电泳检测扩增产量及特异性后,用于DGGE。4、DGGE指纹图谱分析：获得DGGE指纹图谱后,观察和分析DGGE指纹图谱,记录并分析图谱中条带。二、结果1、两种微生物总DNA提取方法提取的16例口腔唾液微生物总DNA的PCR产物经DGGE后均能显示出相应的指纹图谱。可在DGGE图谱上进行明确的区分,且在DGGE图谱中的条带数量,位置及亮度均有差异。2、酚氯仿抽提法提取的口腔唾液微生物总DNA样品检测到DGGE的平均条带数为6.63±2.07,QIAamp DNA Micro Kit法提取的口腔唾液微生物总DNA样品检测到DGGE的平均条带数为10.50±1.41。QIAamp DNA Micro Kit法提取的总DNA样品的微生物物种平均富集大于酚氯仿抽提法提取的总DNA样品,差异有统计学意义(P=0.001)。三、结论1、微生物总DNA提取方法于微生物的多样性和复杂性方面影响着微生物群落的DGGE分析结果。2、应用于PCR-DGGE技术中的微生物总DNA的提取方法,QIAamp DNA MicroKit法较酚氯仿抽提法更能使得DGGE技术灵敏和直观地反映口腔环境微生物多样性和复杂性。第三部分健康青年人口腔微生物群落多样性的比较研究一、方法1、健康青年人口腔唾液样品的采集：依据相应的纳入标准从南方医科大学口腔医学院选取14名口腔健康的学生。每次采集样品前均对所有受检者进行口腔检查并记录口腔状况。采集样品前30min受检者轻轻漱口,采集自然排出唾液2mL,随机选取2名受检者3月后再次进行样品采集。2、口腔微生物总DNA的提取：使用结合预实验进行修改的QIAamp DNA MicroKit法提取健康青年人口腔微生物总DNA。3、口腔微生物16S rDNA基因的PCR-DGGE:对所提取的健康青年人口腔微生物总DNA采用口腔微生物的16S rDNA通用引物的PCR扩增按Viadimir等的方法进行。PCR后产物经电泳检测扩增产量及特异性后,用于DGGE。4、DGGE指纹图谱分析：获得DGGE电泳指纹图谱后,观察图谱,并以“2”、“1”和“0”记录条带的亮度和有无,以Phyltools软件计算样品间DGGE图谱的相似度。以多变量数据统计软件包(MVSP)对数据进行类平均聚类分析(UPMGA),生成聚类图。二、结果1、16例口腔唾液样品提取的DNA经16SrDNA基因PCR产物经琼脂糖电泳,电泳图显示口腔微生物通用引物784DEG/880RDEG对不同个体的口腔微生物16SrDNA基因均得到较好扩增,扩增产量大,无明显副带,为单一条带,大小符合预期。2、16例口腔唾液微生物DNA的PCR产物经DGGE后均能显示出相应的指纹图谱。可在DGGE图谱上进行明确的区分。16个不同样品在DGGE图谱中的条带数量,位置及亮度均有明显差异。但是每个样品均有较明显的亮条带,而且在不同的个体的DGGE图谱上可以观察到几条所共有的亮条带。3、同一个体不同时期样品DNA的PCR产物经DGGE后,DGGE图谱中条带的数目、位置及亮度虽略有差异但基本一致,说明微生物多样性程度十分相似,但仍稍有不同；微生物群落中的优势种群基本无差异。4、UPMGA聚类分析图见,14个受检者口腔环境的样品在聚类图上,各自聚为一簇,来自同一个体不同时期的各样品相似性指数达到0.95以上,不同个体来源的口腔环境中样品相似性指数低于0.90。三、结论1、唾液样品使用QIAamp DNA Micro Kit法提取的DNA可应用于PCR扩增,亦可用于DGGE研究,在DGGE图谱中可观察到较为丰富的口腔微生物的多样性。2、同一个体的口腔中,微生物的分布比较均一,在一定时期内微生物群落组成也相对稳定。3、不同个体的口腔中,微生物多样性程度差异较大,说明不同口腔健康的个体具有其独特的口腔微生物群落,但是拥有共同的优势群落。