黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,简称AFB1)是由真菌寄生曲霉菌(Aspergillus parasiticus)等产毒菌株产生的一种次生型代谢产物。AFB1普遍存在于环境和粮食作物中,给全球带来了巨大的经济损失。近年来,研究发现AFB1对机体免疫系统的破坏可能是疫苗免疫失败和疾病易感性增加的一大原因。但迄今为止研究均停留在动物染毒层面,而在毒素对动物淋巴细胞和巨噬细胞的体外试验却鲜有报道,其抑制作用机理更是未有深入探讨。硒对于人类和各种生命体而言,是一种必需的微量元素。硒主要是通过以硒代半胱氨酸的模式掺入到各种硒蛋白中而发挥它的生物学功能的。虽然目前已有一些文献研究了硒在免疫细胞中的生物学功能,但是在毒素暴露猪免疫细胞上,关于不同硒蛋白的表达差异以及特异性作用的研究仍旧很少。本论文主要对AFB1在体外实验中对猪淋巴细胞和巨噬细胞的免疫毒性作用与细胞氧化还原之间的相互作用及其机理,硒保护AFB1诱导免疫毒性的机理进行了研究和探讨,以期从氧化应激诱导信号通路的角度阐释AFB1的致病机制和硒的保护机制,为硒特别是有机硒在动物生产中的广泛应用提供理论依据。试验一:AFB1对猪原代脾细胞增殖的作用与机制研究本试验的主要研究目的是探究AFB1介导的免疫毒性是否与氧化应激和细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2的表达水平有关。本试验中,从健康猪身上分离原代猪脾细胞并使用抗原特异性的刺激剂anti-pig-CD3单克隆抗体激活。结果显示,同对照组相比,4-8 μg/mL的AFB1显著降低了细胞的增殖水平和白介素2(IL-2)的产量,并呈现剂量依赖效应。此外,在被激活的淋巴细胞中,AFB1显著升高了丙二醛(MDA)的水平,降低了还原性谷胱甘肽(GSH)和总超氧化物歧化酶的水平,并上调了磷酸化ERK的蛋白表达。N-乙酰半胱氨酸阻断了 AFB1诱导的T淋巴细胞增殖抑制,分别通过提高细胞内GSH的水平,降低MDA的水平和下调p-ERK的蛋白表达。通过ERK-siRNA干扰ERK1/2的表达可以减弱由AFB1带来的T淋巴细胞增殖和IL-2产量的降低效果。因此可以得出结论,AFB1抑制anti-CD3刺激的淋巴细胞增殖和IL-2的产生主要是通过激活由氧化应激介导的ERK1/2 MAPK信号通路途径。试验二:硒抑制AFB,诱导猪原代脾细胞免疫毒性的作用及机制研究本试验的主旨是探究硒拮抗毒素的保护作用及其潜在的机理。从健康猪体内原代分离脾细胞,使用anti-pig-CD3单克隆抗体刺激,并使用各种浓度的不同硒形式和AFB1处理细胞。结果表明,硒的添加缓解了由AFB,诱导产生的免疫毒性并呈现剂量依赖机制,具体表现在提高T细胞的增殖和IL-2的产量。同时,硒蛋氦酸(SeMet)相比亚硒酸钠被认为是更安全和效果更佳的。丁硫氨酸亚砜胺的添加可以阻断SeMet的拮抗AFB1的保护作用。无论在有或没有AFB1处理的时候,SeMet能增强谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)、硒蛋白S(SelS)和硫氧还蛋白还原酶1的mRNA水平和GPx1、SelS的蛋白质表达。进一步研究表明,通过 GPx1-specific siRNA and SelS-specific siRNA 干扰沉默 GPx1 和 SelS,可以削弱SeMet对AFB1诱导的免疫毒性的保护作用。因此可以得出结论,在原代猪脾细胞中,SeMet通过增强抗氧化水平和提高硒蛋白的表达缓解由AFB,诱导的免疫损伤。试验三:AFB1对猪3D4/21细胞的免疫毒性作用与机制研究为了进一步研究AFB1对猪免疫细胞的毒性作用,应用了猪传代巨噬细胞3D4/21为模型,测定了细胞培养后48和72 h的MTT、IL-1 α和TNF-α的mRNA水平,应用荧光显微镜观察了毒素暴露后的细胞形态变化和凋亡,并应用流式细胞术测定ROS水平和添加NAC来探究AFB,诱发免疫毒性的潜在机制。同时,为了研究其中的信号通路机制,应用荧光定量PCR和western blot测定了 TLR4受体的mRNA和蛋白表达水平,和p-p38、p-ERK1/2、p-p65等蛋白表达水平。结果显示,不同剂量的AFB1可以显著降低细胞活力,诱导3D4/21细胞的凋亡,同时低剂量的AFB,可以显著提高3D4/21细胞分泌炎性细胞因子IL-1 α和TNF-α的mRNA表达,在氧化还原方面,AFB1的暴露增加了 ROS的水平,添加NAC可逆转AFB1引起的细胞凋亡和促炎性因子升高,一定程度上减弱AFB1对猪3D4/21细胞的免疫毒性作用,证明AFB1对3D4/21细胞的免疫毒性作用可以通过提高细胞内ROS的水平来实现。在信号通路方面,AFB1的暴露显著促进了细胞内TLR4和磷酸化p38、NF κB的表达水平。通过siRNA干扰TLR4的表达可以减弱由AFB1带来的3D4/21细胞凋亡和促炎性因子释放的增加。这些结果表明,AFB1引起肺泡巨噬细胞3D4/21细胞的凋亡和促炎性细胞因子的升高主要是通过激活由氧化应激介导的TLR4-NF κ B信号通路途径。试验四:硒抑制AFB1诱导猪3D4/21细胞免疫毒性的作用及机制研究之前的调查研究鲜有涉及硒保护因AFB,诱导产生免疫毒性的信号通路研究。本试验的主旨是探究硒在3D4/21上拮抗毒素的潜在机理与方法。本试验应用3D4/21细胞为模型,使用各种浓度的不同硒形式和AFB,处理细胞。研究结果表明,通过MTT的结果发现有机硒在一定浓度范围内对3D4/21细胞无毒性作用。流式细胞术的结果显示SeMet可以降低AFB1诱导的活性氧ROS和细胞凋亡水平。另外,添加SeMet后,毒素处理组3D4/21细胞分泌炎性细胞因子IL-1α和TNF-α的mRNA水平降低了。AFB1暴露的3D4/21细胞中添加SeMet能增强硒蛋白S(SelS)的蛋白质表达。SelS-specificsiRNA对细胞活力、IL-1α和TNF-α的水平无显著影响。使用SelS-specific siRNA可以削弱SeMet对毒素的保护作用,表明在提高凋亡水平、ROS水平和细胞因子水平上。同时,干扰SelS可以上调p-38和p-65的表达。这些结果证明,在猪传代巨噬细胞3D4/21中,SeMet通过提高SelS的表达,来增强抗氧化能力,而SelS是通过抑制TLR4-NFκB信号通路的表达来保护细胞免受AFB,诱导的免疫毒性。试验五:过表达SelS抑制AFB1诱导3D4/21细胞免疫毒性为了更加深入地探究硒阻断AFB1对3D4/21细胞免疫毒性的机制,应用了过表达SelS的3D4/21细胞为模型。将已经成功构建的重组子pcDNA-SelS采用脂质体转染的方法,转染至猪肺泡巨噬细胞3D4/21,并用G418进行筛选。对得到的细胞检测细胞中SelS蛋白的表达水平。随后测定了细胞凋亡水平、促炎性细胞因子水平、ROS和TLR4-NFκB信号通路水平。结果显示,过表达SelS可以保护3D4/21细胞拮抗AFB1的细胞免疫毒性,表现在降低凋亡水平和促炎性因子释放水平,减少细胞内ROS的产生,和抑制p38和p65的磷酸化上。进一步证明SelS阻断AFB1诱导的3D4/21细胞免疫毒性是通过抑制氧化应激和TLR4-NFκB信号通路的磷酸化。