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背景:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是导致急慢性肝炎的关键因素,并可逐步发展为肝硬化和肝癌,每年约有100万人死于HBV相关的各种终末期疾病,HBV感染已成为威胁人类健康的重要病因。因此,防治HBV感染的工作显得尤为重要。目前,HBV疫苗已得到广泛使用,干扰素和核苷酸类似物已用于临床治疗乙型肝炎,但分别存在疫苗接种失败、副反应严重和耐药等缺点,所以阐明HBV复制调控的分子机制,鉴定HBV感染过程中的关键宿主因子,寻求新的药物治疗靶点具有非常重要的意义。SIRT1是依赖于烟碱胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶,也是HBV cccDNA微染色体的组成成分之一,SIRT1与多种细胞功能密切相关,越来越多的报道显示其可调节病毒在体内的感染过程,但是SIRT1可否直接调控HBV的生活周期尚不十分明确。目的:1.研究SIRT1对HBV复制和转录的影响。2.阐明SIRT1调控HBV感染的分子机制。3.在体内外研究SIRT1抑制剂对HBV复制的影响。1.qrt-pcr和westernblot检测hbv稳定复制细胞系(hepg2.2.15和hepg2-hbv1.1)与对照细胞(phh和hepg2)中sirt1的mrna和蛋白水平,进一步检测hbv瞬时表达对sirt1的mrna和蛋白表达水平的影响。2.在hepg2.2.15和hepg2-hbv1.1细胞中转染慢病毒介导的靶向沉默sirt1表达的shrna(shcont、shsirt1-1、shsirt1-2)或sirt1过表达质粒,real-timepcr和southernblot检测sirt1沉默或过表达对hbvdna复制中间体表达水平的影响,qrt-pcr分析sirt1沉默或过表达对hbv3.5kbmrna转录的影响,westernblot和elisa分别检测sirt1沉默或过表达对hbvcoreprotein(hbc)和hbsag、hbeag分泌的影响。3.real-timepcr和southernblot检测sirt1沉默对转染pgem-hbv1.3或环化hbv的huh-7细胞中hbv复制的影响。4.hepg2细胞中共转染hbv启动子和过表达sirt1质粒,双荧光素酶报告系统分析过表达sirt1对hbv启动子活性的影响,并检测sirt1沉默对hbvcp启动子活性的影响5.hepg2.2.15细胞中沉默sirt1的表达,qrt-pcr筛选受sirt1调控的与hbv转录有关的转录因子,westernblot进一步检测sirt1对目标转录因子ap-1亚基c-jun蛋白水平表达的影响。6.染色质免疫共沉淀技术(chip)分析c-jun与hbvcp有无结合。7.突变c-jun与pgem-hbv1.3中hbvcp的结合位点,real-timepcr和southernblot检测sirt1对突变型hbvdna复制中间体表达方法:的影响。8.在hepg2细胞中通过双荧光素酶报告系统分析c-jun沉默对sirt1促进hbvcp启动子活性的影响,real-timepcr和southernblot检测c-jun沉默对sirt1增加hepg2.2.15和hepg2-hbv1.1细胞中hbvdna复制中间体表达水平的影响。9.mts实验分析sirt1抑制剂nicotinamide在hepad38和hepg2.2.15细胞中的cc50。10.在hepad38和hepg2.2.15细胞中加入不同浓度的nicotinamide,real-timepcr和southernblot检测nicotinamide对hbvdna复制中间体表达水平的影响,qrt-pcr分析nicotinamide对hbv3.5kbmrna转录的影响,westernblot和elisa分别检测nicotinamide对hbvcoreprotein(hbc)表达和hbsag、hbeag分泌的影响。11.在hbv转基因小鼠(c57bl/6j)中,通过尾静脉注射不同浓度的nicotinamide溶液,微板法检测小鼠血清中ast和alt水平,real-timepcr分析小鼠血清和肝组织中hbvdna水平,elisa检测小鼠血清中hbsag、hbeag水平。结果:1.sirt1的mrna水平(p<0.05)和蛋白水平在hbv稳定复制细胞系中明显高于对照细胞,hbv瞬时表达后sirt1的mrna水平(p<0.05)和蛋白水平也显著增加。2.sirt1沉默可显著抑制hbv复制细胞(hepg2.2.15和hepg2-hbv1.1细胞)中hbvdna复制中间体(p<0.01)、hbv3.5kbmrna(p<0.01)、hbc的表达水平,hbsag和hbeag的分泌水平(p<0.05);过表达sirt1则明显促进了hepg2.2.15和hepg2-hbv1.1细胞中hbvdna复制中间体(p<0.01)、hbv3.5kbmrna(p<0.01)的表达水平、及hbsag和hbeag的分泌(p<0.05)。3.在转染pgem-hbv1.3或环化hbv的huh-7细胞中sirt1沉默显著抑制了hbvdna复制中间体的表达水平(p<0.05)。4.sirt1过表达可明显促进hbvcp的启动子活性(p<0.001),而对hbvspi、spii、xp的启动子活性无显著影响;sirt1沉默可显著抑制hbvcp的启动子活性(p<0.001)。5.hepg2.2.15细胞中sirt1沉默明显下调了转录因子ap-1亚基c-jun的mrna水平(p<0.01)和蛋白水平,sirt1过表达明显促进了c-jun的蛋白表达水平。6.c-jun可结合于hbvcp区域。7.pgem-hbv1.3中ap-1位点突变后,sirt1不能发挥增强hbv复制的作用。8.c-jun沉默减弱了sirt1对hbvcp启动子活性和hbv复制中间体表达的促进作用。9.nicotinamide在hepad38和hepg2.2.15细胞中的cc50分别是36.38mm和44.44mm。10.nicotinamide处理显著抑制了hepad38和hepg2.2.15细胞中hbvdna复制中间体(p<0.05)、hbv3.5kbmrna(p<0.01)、hbc的表达水平,及hbsag和hbeag的分泌水平(p<0.05)。11.Nicotinamide处理对小鼠血清中AST和ALT的水平无明显影响;不同浓度的nicotinamide处理可以浓度梯度依赖的方式下调小鼠血清中HBV DNA拷贝数(P<0.05)及HBsAg和HBeAg水平(P<0.05);nicotinamide处理组小鼠肝组织中HBV DNA拷贝数显著低于未处理组(P<0.05)。结论:在本研究中,我们阐明了SIRT1在HBV复制中的作用。研究数据显示SIRT1表达水平在HBV复制细胞中显著上调;SIRT1沉默或过表达能调控HBV复制。此外,SIRT1可通过转录因子AP-1增强HBVCp启动子活性。上调SIRT1的表达;SIRT1增加转录因子AP-1的表达,增强HBV Cp的活性,从而促进HBV的转录和复制;SIRT1抑制剂nicotinamide在不导致细胞毒性或肝损伤的情况下抑制了HBV稳定表达细胞系和HBV转基因小鼠中HBV的复制。