研究目的:骨关节炎作为目前老年人最严重的关节疾病,也是致残的主要原因之一,目前病因尚不明确。围绝经期女性骨关节炎发病率显著升高,而此时重要的临床特征之一即FSH水平的升高。为探究FSH与骨关节炎之间的关系,在既往研究中,我们发现了 FSH受体在人和小鼠软骨细胞上表达,但FSH对软骨细胞如何产生及产生了何种影响尚不清楚。本实验拟通过动物实验验证FSH在体内对软骨细胞的影响。体外实验通过转录组学测序并进行生物信息学分析,探究FSH对软骨细胞转录水平产生的影响,并通过RNA水平、蛋白水平等对差异基因进行验证,并探究部分通路的变化。方法:1.通过对雌性C57BL/6J小鼠进行内侧半月板失稳术造成骨关节炎动物模型,对小鼠膝关节腔内注射FSH后分别在4周与8周时处死小鼠进行组织切片,行番红固绿染色观察高FSH在体内对软骨影响。2.提取新生小鼠原代软骨细胞进行培养,根据是否加入FSH刺激与是否干扰FSHR将实验分为四组,即SiNC组,SiNC+FSH组,Si FSHR组,SiFSHR+FSH组。使用TRIZOL法提取RNA后基于Illumina测序平台进行测序,对测序得到的原始数据进行过滤以得到高质量的测序数据。3.使用HISAT2构建参考基因组的索引,并将配对末端clean reads与参照基因组比对。使用FPKM法进行基因表达水平定量。使用DESeq2软件（1.16.1）进行两个比较组合之间的差异表达分析。通过clusterProfiler R软件实现差异表达基因的GO富集分析及KEGG富集分析,通过STRING数据库对差异基因进行蛋白互作网络分析。4.通过对ATDC5细胞进行培养及加入ITS诱导分化成软骨细胞,加入FSH刺激后提取RNA及蛋白,通过qRT-PCR,Western blot及免疫荧光验证所筛选到的部分差异基因。5.在FSH刺激软骨细胞后,通过ELISA法检测cAMP的变化,通过We stern blot验证PKA,JNK,p-JNK通路蛋白的表达量变化。结果:1.行内侧半月板失稳术后,小鼠膝关节出现明显病损,Mankin’s评分也明显升高,骨关节炎模型建立成功。而对小鼠膝关节腔注射FSH后,无论假手术组或手术组,均出现不同程度的关节损伤。且注射FSH后,每一组的Mankin’s评分均较注射生理盐水组更高。2.将转录组学原始数据过滤,可以看到cleanreads均大于4.4*10^7,碱基长度均大于6.73G,错误率均仅为0.02%,Q20>98%,Q30>94.4%。通过将质控后的clean reads比对到参考基因上,所有样本对比到参考基因组上的mapping数占96.22%-97.85%。用于后续定量分析的 unique map 占 91.48%-93.1%。multi map 则均小于5.01%。进行相关性检验,可以看到每个样本之间的皮尔森系数R2均大于0.98。3.在对照组与FSH组之间,共筛选到1308个差异基因,其中上调基因共664个,如 Col12a1,Col1a1,Col5a1,Col3a1,Egr1 等,下调基因 644 个,如 Mgp,Hmgn2,Emb,Timp1,Cd24a等。进行富集分析,富集较显著的GO子集包括细胞外基质形成,细胞外结构形成,结缔组织发育,软骨发育等。将差异基因进行KEGG富集,共富集到293个通路,可以看到富集较明显的KEGG通路包括蛋白质的消化与吸收,细胞外基质受体相互作用,氧化磷酸化等通路。通过蛋白质互作网络则发现IL-6与多数胶原相互作用。4.在RNA水平进行验证,FSH刺激后EGR1,Col1a1表达量均升高,与转录组学结果一致。在蛋白水平,随FSH刺激浓度的升高,EGR1与Col1a1表达量也逐渐增加,呈剂量-效应依赖关系。此外炎症因子IL-6在FSH刺激后在RNA与蛋白质水平也升高,免疫荧光实验亦证明IL-6在FSH组表达量升高。5.在FSH刺激后,cAMP/PKA表达量均下降,总JNK不变,p-JNK水平下降,JNK磷酸化被抑制。结论:FSH可以通过抑制cAMP/PKA通路,抑制JNK磷酸化,引起关节内的炎症反应及软骨细胞去分化,导致软骨细胞内稳态的失衡,从而引起或加重骨关节炎,这也解释了为何绝经期女性骨关节炎患病率的突然升高。