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目的:对藤黄微球菌（Micrococcus luteus）过氧化氢酶（catalase A,CAT）发酵条件进行优化,优化catalase A的产酶条件。对M.luteus进行物理诱变和化学诱变,筛选catalase A正诱变菌株。扩增M.luteus catalaseA基因,构建pProExHTa-CAT重组子,实现catalase A在大肠杆菌中的高效表达,通过金属离子亲和层析法纯化表达蛋白,并对纯化后蛋白的性质进行初步研究,为后续探讨M.luteus IFO 3064的抗过氧化氢氧化机制和抗氧化酶防御体系以及对重组CAT的开发应用奠定基础。方法:本研究分为五个部分:1.初步对藤黄微球菌M.luteus IFO 3064过氧化氢酶发酵条件优化,提高过氧化氢酶catalase A的产酶条件和酶活。2.通过紫外诱变、NTG诱变,筛选酶活提高的正诱变菌株。3.藤黄微球菌过氧化氢酶基因原核表达载体的构建:用PCR方法自M.luteus ACCC 41016基因组中扩增catalase A目的片段,并将该基因亚克隆至克隆载体pMD18-T中,利用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。用EcoRⅠ+HindⅢ双酶切验证和基因序列测定鉴定pMD18-CAT重组子。该克隆质粒EcoRⅠ+HindⅢ双酶切后,回收含CAT基因的酶切产物,与同样双酶切后回收的pProEx-HTa质粒片段连接,构建重组表达质粒pProExHTa-CAT,再双酶切验证和基因序列测定鉴定pProExHTa-CAT重组子。4.过氧化氢酶融合蛋白的表达及纯化:pProExHTa-CAT重组质粒转化至宿主菌DH5α,IPTG诱导CAT融合蛋白表达,SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况;通过Ni2+-NTA柱子离子亲和层析对CAT融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE检测蛋白纯度和亚基分子量。5.过氧化氢酶融合蛋白的性质研究:包括纯化产物总蛋白含量测定,CAT活性测定,CAT的pH稳定性、温度稳定性研究。结果:1.初步优化M.luteus IFO 3064 Catalase A发酵条件:牛肉膏2g/dL,MgCl2 0.25/dL,蛋白胨1g/dL,pH 6.5,发酵时间44h。2.通过对M.luteus IFO 3064进行紫外诱变和化学诱变,筛选到三株正诱变菌株,其酶活可提高2～3倍。3.成功构建M.luteus catalase A原核克隆重组质粒pMD18-CAT。此质粒经EcoRⅠ+HindⅢ双酶切后,得到克隆载体片段（2.7kb）和目的基因片段（1.5 kb）;经测序,目的基因全长1 518bp,与GenBank所公布的序列相比较,存在三个碱基的差异,同源性可达99.8%。再将双酶切的CAT片段和酶切的表达质粒连接,成功构建原核表达质粒pProExHTa-CAT,此质粒经双酶切后,得到表达载体片段（4.7kb）和目的基因片段（1.5kb）;经测序,目的基因全长1 509bp,与GenBank所公布的序列相比较,存在六个碱基的差异,同源性为99.6%;融合蛋白编码序列全长1 509bp,编码含503个氨基酸残基的多肽链,与GenBank所公布的序列相比较,存在两个氨基酸的差异,同源性为99.6%。4.经1mM IPTG诱导,含pProExHTa-CAT的表达宿主菌DH5α在60.3 kD处有明显的表达条带,与核酸序列测定所推导预计的CAT融合蛋白分子量相符。通过镍金属离子亲和层析对表达产物进行纯化,可得到电泳纯的CAT融合蛋白。5.纯化产物经证实为过氧化氢酶,活性可达166U/（mg·protein）,其活性在pH5～8、温度25～50℃范围内较为稳定。结论:初步优化了M.luteus catalase A的发酵条件;筛选到诱变后酶活提高的正诱变菌株;成功构建了原核表达重组质粒pProExHTa-CAT,实现了M.luteus的catalase A基因在原核细胞中的高效表达。通过金属离子亲和层析可以简便、快速地得到电泳纯的CAT融合蛋白,纯化产物活性较高、稳定性较好,为阐明藤黄微球菌抗过氧化氢氧化的机理和CAT在该菌抗氧化酶防御体系中的作用、以及进一步探索catalase A的简便高效的生产方法奠定了基础,具有重要的理论意义和现实意义。