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研究背景及目的化学物质引起的局部眼刺激作用，通常涉及结膜、角膜、虹膜和泪腺的刺激效应，以角膜的刺激作用为首，其次是结膜、虹膜。传统的眼刺激作用，采用动物试验进行评价，鉴于其备受质疑的合理性和伦理性，此法已不能满足当前产品风险评估和法规管理的需要。基于体内眼刺激作用发生的机制，目前已开发了多种替代动物试验的方法。单一体外方法可较好地模拟复杂眼损伤作用中的某个方面，但如何组合使用，以满足实际工作需要，尚有待深入研究。因此，有必要根据角膜损伤的发生机制，结合体外方法的原理和标准化应用程度，对目前眼刺激实验的诸多替代方法的科学性和适用性进行评估。在此基础上，根据试验目的，建立成组的体外方法策略，以完全取代动物测试，满足风险决策和安全评价的需要。本研究建立鸡胚尿囊膜绒毛膜苔盼蓝染色实验（Chicken ChorioallantoicMembrane-Trypan Blue Staining，CAM-TBS）、红细胞溶血实验（Red blood cellhaemolysis test，RBC）和SIRC细胞短时暴露实验（Short-term exposure，STE）三种眼刺激实验替代方法，并评估其单独或组合用于风险决策系统的科学性和局限性。为下一步建立眼刺激实验体外替代方法的组合模式提供支持。以满足替代动物实验的法规要求，也为产品安全性评价的风险决策提供资料。是今后推动我国眼刺激评价的体外标准化检测方法的铺垫。研究方法1鸡胚尿囊绒毛膜苔盼蓝染色实验（CAM-TBS）该实验利用鸡胚绒毛膜尿囊膜结构与人结膜相似的特点，在定性观察的基础上，建立定量检测的方法。通过观察化合物作用于CAM引发出血、血管溶解和凝血反应的损伤程度，并测定CAM吸收台盼蓝的量，从而定量检测受试物损伤作用，提高了实验的可重复性。2红细胞溶血实验（RBC）通常具有眼刺激作用的物质也能使蛋白质变性或细胞膜溶解。将化合物直接接触哺乳动物的红细胞，通过定量检测红细胞溶血，以及释放出细胞外的血红蛋白变性程度，模拟类似角膜的损伤作用。3SIRC细胞短时暴露实验（STE）化合物直接作用于角膜引起的刺激作用类似于细胞毒性损伤作用。通过检测细胞毒性指标，可反应角膜损伤的程度。实验采用体外培养的兔角膜细胞（SIRC），短期暴露细胞于化合物，模拟急性角膜刺激作用，计算细胞活性、生长的抑制程度，及其与化学物的浓度-效应关系。4提出替代方法的组合策略基于危害物质风险评估的基本理论与原则，在参考国内外眼刺激试验最新法规认可与标准进展的基础上，提出以三种替代方法为主体的眼刺激试验风险评估组合策略。实验结果1鸡胚尿囊绒毛膜苔盼蓝染色实验（CAM-TBS）苔盼蓝浓度与吸光度OD值间存在正相关，回归模型表达式为y=0.2968+0.0004x回归系数的区间估计：95%CI=[0.0002，0.0005]。R2=0.8994，表明利用苔盼蓝浓度变量可以解释吸光度OD值变异情况的89.94%。2红细胞溶血实验（RBC）对RBC实验与Draize实验的受试物分类做配对资料的Wilcoxon符号秩和检验，得S=1.8182，p=0.9976，在检验水准α=0.05的水平下，两者之间的差异没有统计学意义。经一致性检验，得出Kappa=0.6356，置信区间为[0.3930,0.8781]；RBC实验和Draize兔眼实验结果的一致性较好。3SIRC细胞短时暴露实验（STE）SIRC细胞短时暴露实验（STE）所分的结果，与Draize兔眼实验分类结果相比较，经过kappa一致性检验，kappa值=0.6316，95%可信区间为[0.4040,0.8592]，两种分类一致性较好。4替代方法组合试验策略本组合适用于无刺激性到严重刺激性范围内眼刺激危害性的评价，对于无刺激性到中等刺激性的区分优势明显，三种方法组合流程见下图。根据受试物的理化特性，预期为有刺激性的物质先进行CAM-TBS测试，若测试结果为严重刺激性，则可直接分类为严重刺激性；若测试结果为非严重刺激性，则进行细胞短期暴露测试或红细胞溶血试验，若为表面活性剂或含表面活性剂配方，则进行红细胞溶血试验，其它物质则选择细胞短期暴露试验，根据试验结果可对受试物眼刺激性分类。预期为无刺激性的物质，若为可溶性物质或配方，先进行细胞短期暴露测试，若测试结果为无刺激性，则可直接分类为无刺激性；若为表面活性剂或含表面活性剂配方，则需要补充红细胞溶血试验加以确认或直接用此法进行测试。若结果有刺激性，则进行CAM-TBS测试，确认并区分刺激的严重程度。结论本研究选择CAM-TBS、RBC和STE三种眼刺激实验替代方法，模拟结膜和角膜受损的机制，在改进试验材料和试验方案的基础上，探索建立替代实验组合。实验结果与Draize兔眼实验结果相比，这三种方法的体内相关性、分级一致性和结果重现性均良好。三种方法均可定量检测化合物的眼刺激性。并且三者适用于不同的化合物，化合物的眼刺激性分类范围也不同。对于严重刺激性物质，CAM-TBS实验分类较好；中等/温和刺激性物质分类，RBC实验分类较好；弱/无刺激性物质分类，STE实验分类较好。CAM-TBS实验可用于测试单一化合物或混合物，该方法不适合用于有色严重刺激性物质的分类。RBC实验与STE实验适用于可溶解性物质的检测，但不适用于难溶物质或混合物的测试，且前者对表面活性剂更敏感。综合考虑三种方法的优点和局限性，初步提出组合使用结论：CAM-TBS实验与RBC实验组合对严重刺激性物质分类较准确；CAM-TBS实验与STE实验组合分类对无刺激到中等刺激性物质分类相对一致性高；RBC实验与STE实验组合适用于弱/无刺激性可溶解性物质的分类。