【摘 要】
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糖尿病及各类感染性疾病的预后及并发症的发生发展与机体血糖水平密切相关,其机制与血糖异常使机体产生大量的活性氧簇（ROS）,激活p53信号通路诱导细胞凋亡,以及与胞内K+外流共同激活NLRP3信号通路诱导细胞焦亡有关。除肝脏是机体血糖代谢的重要器官外,肾脏也通过糖异生和对葡萄糖的重吸收在糖代谢稳态中发挥重要作用。因此,本试验基于p53和NLRP3信号通路研究了糖浓度异常对牛肾脏细胞（MDBK细胞）凋
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2018YFD0501800）； 四川省科技计划项目（2018NZ0002）； 四川省科技计划项目（2019YFQ0012）:肉牛清洁生产与种养循环关键技术的研究与示范； 国家现代农业产业技术体系四川肉牛创新团队项目（SCCXTD-2020-13）；
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糖尿病及各类感染性疾病的预后及并发症的发生发展与机体血糖水平密切相关,其机制与血糖异常使机体产生大量的活性氧簇（ROS）,激活p53信号通路诱导细胞凋亡,以及与胞内K+外流共同激活NLRP3信号通路诱导细胞焦亡有关。除肝脏是机体血糖代谢的重要器官外,肾脏也通过糖异生和对葡萄糖的重吸收在糖代谢稳态中发挥重要作用。因此,本试验基于p53和NLRP3信号通路研究了糖浓度异常对牛肾脏细胞（MDBK细胞）凋亡与焦亡的影响。1.糖浓度异常对MDBK细胞培养的影响:（1）用5 mmol/L和25 mmol/L的葡萄糖孵育MDBK细胞至预定时间（0h、6h、12h、24h、36h、48h）,用流式细胞仪检测细胞的Annexin V和PI阳性率。结果表明,25 mmol/L的葡萄糖孵育24h、36h、48h,MDBK细胞的Annexin V和PI阳性率均显著高于5 mmol/L的葡萄糖组（P<0.05）,尤其Annexin V阳性率。（2）糖波动孵育48h（即:先用葡萄糖2.5 mmol/L孵育24h后,再用25 mmol/L孵育24h）,MDBK细胞中的Annexin V和PI阳性率也均显著高于5 mmol/L的葡萄糖组（P<0.05）,尤其PI阳性率。2.糖浓度异常对MDBK细胞凋亡的影响机制:（1）将MDBK细胞分别用2.5 mmol/L、5 mmol/L、25 mmol/L（高糖）的葡萄糖孵育48h;糖波动处理（同1.（2））。结果表明,高糖或糖波动处理MDBK细胞Annexin V阳性率以及胞内ROS水平较2.5 mmol/L与5mmol/L组显著增加（P<0.05）;Bax、Caspase-9、Caspase-3、Nox4等基因表达水平显著上调（P<0.05）,p53的基因和蛋白表达水平均显著上调（P<0.05）,其中高糖对上述指标的影响较糖波动更大;2.5 mmol/L组Nox4基因表达水平较5 mmol/L组显著上调（P<0.05）,其余上述指标较5 mmol/L组无显著差异（P>0.05）。（2）先用1 mmol/L的NAC预处理1h后,再分别用5 mmol/L或25 mmol/L的葡萄糖孵育MDBK细胞48h或糖波动处理。结果发现,NAC能显著抑制高糖或糖波动引起的胞内ROS水平以及Annexin V阳性率的升高（P<0.05）,以及p53、Caspase-3、Nox4的基因与p53的蛋白表达上调（P<0.05）。3.糖浓度异常对MDBK细胞焦亡的影响机制:（1）将MDBK细胞分别用2.5 mmol/L、5 mmol/L、25 mmol/L（高糖）的葡萄糖孵育48h;糖波动处理（同1.（2））。结果表明,高糖组MDBK细胞的PI阳性率以及胞内ROS水平较2.5 mmol/L、5 mmol/L组显著上调（P<0.05）,其中Txnip、Nlrp3、Nox4的基因表达也显著上调（P<0.05）;而糖波动MDBK细胞PI阳性率以及胞内ROS水平,胞内K+浓度以及上清液中IL-1β和IL-18的蛋白浓度均显著高于2.5 mmol/L与5 mmol/L组（P<0.05）,其中Txnip、Nlrp3、Caspase-1、Gsdmd、Nox4、P2x4基因表达以及NLRP3的蛋白表达也显著上调;2.5 mmol/L组Nox4基因表达水平较5 mmol/L组显著上调（P<0.05）,其余上述指标较5 mmol/L组无显著差异（P>0.05）。（2）先用1 mmol/L的NAC,或2μmol/L的5-BDBD,或10 nmol/L的MCC950预处理1h;再分别用5 mmol/L,25 mmol/L的葡萄糖孵育48h,或糖波动处理。结果,经NAC、5-BDBD、MCC950等抑制剂处理后,糖波动组MDBK细胞的PI阳性率,Nlrp3、Caspase-1、Gsdmd基因表达,NLRP3蛋白表达以及上清液中IL-1β和IL-18的蛋白浓度的上调均受到显著抑制（P<0.05）。结论:（1）高糖或糖波动处理增加MDBK细胞内ROS水平引起氧化应激,诱导细胞凋亡的发生,其机制与激活p53及其下游Bax/Caspase-9/Caspase-3信号通路有关,且高糖的影响较糖波动更大。通过用NAC抑制MDBK细胞ROS的产生,可抑制p53信号通路的激活。（2）糖波动增加MDBK细胞内ROS水平并启动K+外流,进而诱导细胞焦亡的发生;用NAC、5-BDBD、MCC950分别通过抑制ROS增加、K+外流、NLRP3激活,则可抑制细胞焦亡的发生;揭示糖波动引起MDBK细胞焦亡的机制与ROS的增加及K+外流,导致NLRP3及其下游Caspase-1/GSDMD信号通路激活密切相关。而高糖仅上调NLRP3的基因表达水平,对其蛋白表达及下游的信号通路无显著影响。糖波动导致MDBK细胞的损伤机制与ROS大量产生及其导致的细胞凋亡和细胞焦亡有关,而高糖仅与ROS大量产生及其导致的细胞凋亡有关。
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