研究目的：迄今为止,器官移植仍是挽救终末期脏器功能衰竭而又缺乏有效替代疗法患者生命的唯一手段。随着免疫抑制疗法的不断改善和广泛应用,术后移植物的短期存活率得到明显提高。然而,持续的免疫损伤和长期应用免疫抑制剂产生的毒副作用仍然严重影响着移植物的长期存活和受体患者生活质量。因此术后对移植物耐受状态的实时动态检测和机体免疫耐受新的调节机制的进一步探索阐明对移植排斥反应早期诊断和治疗方案的及时调整都具有重要意义。目前,除了活检以外,移植物状态的无创性检测方法大多依赖与对急性排斥反应的生物学特征或者炎症反应的早期检测。然而,移植术后临床上免疫抑制剂的广泛使用,使急性排斥反应的监测受到了严重影响,如18F-FDG(18氟标记的氟代脱氧葡萄糖)的PET/CT检查。18F-FDG是一种在正电子发射断层扫描成像常用的放射性药物,近年来它被应用于移植术后移植物排斥的检测和评价免疫抑制剂的疗效。当发生急性排斥反应时,移植物对18F-FDG的摄取明显升高,然而这种PET图像上的强信号却因为免疫抑制剂的使用而受到严重影响,有可能误导临床判断。研究发现,应用了免疫抑制剂后,模型动物的移植物对18F-FDG的摄取均很低,表明18F-FDG可用来评价免疫制剂的疗效,但是对评估移植物存活的长期检测却并不适用。由于诱导和维持供体特异性的免疫耐受是器官移植后的首要目标,因此探讨发现高灵敏高特异的的与移植物耐受状态相关的标志物对临床器官移植后的预后判断和及治疗措施调整十分重要。TLR样受体(Toll-like Receptor)家族是一种表达在白细胞和固有免疫细胞中的模式识别受体(PRR, pattern recognition receptor),不仅在天然免疫系统中发挥重要作用,而且还调节获得性免疫。近期研究表明,TLR5很可能是一个潜在的具有免疫调节功能靶点。TLR5识别细菌表达的鞭毛蛋白,通过MyD88的级联信号作用激活NF-κB。研究证明,TLR5在CD4+CD25+调节性T细胞(Regulatory T cell, Treg)高表达并且与之免疫抑制能力有潜在的联系。鞭毛蛋白通过活化TLR5信号同路能够减轻在异基因造血干细胞移植引起的急性移植物抗宿主病(acute Graft-versus-host disease, aGVHD)。我们实验室的前期研究结果显示在同种异体移植模型中,免疫抑制剂雷帕霉素的使用可以上调移植物TLR5和Foxp3 (Forkhead transcription factors 3,叉头样转录因子3)的表达。继而又证实在同种异体移植模型中应用基因重组表达的鞭毛蛋白rFlic可以扩增受体CD4+CD25+Treg细胞的比例、上调Foxp3的表达、增强其抑制功能,从而达到协同诱导免疫耐受的作用。因此,我们提出科学假设：TLR5的表达有可能与雷帕霉素诱导的移植物耐受相关并且参与对移植耐受分子机制的调节。在研究过程中,我们发现自噬与TLR5和雷帕霉素均相关。自噬是一种细胞内的分解代谢过程,参与胞质内蛋白和细胞器的降解与更新。它既调节固有免疫应答,也参与调节适应性免疫应答。近来研究发现,自噬在中央耐受和外周耐受中更是起了十分关键的作用。在基因敲除Beclinl基因后的CD4+T细胞,缺少了自噬,在TCR刺激后,与细胞死亡相关蛋白(如procaspase-3, procaspase-8和Bim)的表达升高,更易发生凋亡。然而自噬是否在同种移植排斥过程中的发生变化,有何作用,目前仍不明确。综上所述,本论文分为三部分对TLR5与Autophagy在同种移植耐受的实时动态显像和分子调节机制进行了系统的深入研究。1、选择免疫抑制剂雷帕霉素诱导的小鼠同种移植模型,以TLR5为靶点,制备放射性核素131-I标记的抗TLR5单克隆抗体为分子显像剂,通过体内注射,对移植排斥模型进行动态对比监测,为无创性移植耐受后的移植物实时监测探索新的途径;2、在同种移植模型中,通过与非特异性显像剂18F-FDG和同种型IgG进行对比,评价TLR5作为特异性耐受显像剂在雷帕霉素使用后对移植物的显像价值；3、对比研究自噬在同种移植模型移植排斥过程中变化及意义,初步探讨其影响同种移植排斥的可能的分子机制。第一部分 靶向TLR5的放射性核素标记抗体对雷帕霉素治疗的同种移植物动态监测研究方法1、小鼠同种移植模型的建立以C57BL/6小鼠为供体,将其背部全厚度皮肤移植到受体BALB/c小鼠,建立同种移植排斥模型；分为对照组和雷帕霉素处理组,处理组在移植术后每日腹腔注射雷帕霉素1.5mg/Kg直至对照组移植皮肤完全被排斥,对照组术后每日腹腔注射等量的PBS(phosphate buffered saline)。2、131I标记的放射性示踪剂的制备和体外结合实验Iogogen法制备并纯化131Ⅰ-anti TLR5 mAb。分别将131Ⅰ-anti TLR5 mAb置于小鼠血清和生理盐水中,37℃水浴,0h,12 h,24 h,48 h,72 h和96h分别检测标记物体外稳定性。通过BALB/c小鼠脾细胞的单位点放射性配体与受体结合分析检测131Ⅰ-anti TLR5 mAb r Kd,, Bmax和KI值。3、131Ⅰ-anti TLR5 mAb在同种移植模型中的体内生物学分布研究在移植术后第7天向2组实验小鼠尾静脉分别注射131Ⅰ-anti TLR5 mAb(0.37MBq/只),在注射后1h,12h,24 h,48 h和72 h,分别各取5只小鼠,脱颈椎处死,收集血液、移植皮肤、对侧正常皮肤以及各个器官组织,称重,测量放射性,研究131Ⅰ-anti TLR5 mAb在模型小鼠体内的生物学分布状况,并计算靶(移植皮肤)与非靶(对侧正常皮肤)放射性分布的比值。4、131Ⅰ-anti TLR5 mAb在同种移植模型中的动态磷屏自显影显像研究在移植术后第7天向两组实验小鼠尾静脉分别注射131Ⅰ-anti TLR5 mAb (0.37MBq/150 μl只),在注射后1h,12 h,24 h,48 h和72 h进行放射性磷屏自显影显像,观察131Ⅰ-anti TLR5 mAb及对照抗体在移植部位的摄取状况。另有一组雷帕霉素治疗小鼠在尾静脉注射131Ⅰ-anti TLR5 mAb前半个小时尾静脉注射未标记的anti TLR5 mAb,进行阻断实验,确定131Ⅰ-anti TLR5 mAb摄取的特异性。5、免疫组织化学染色检测TLR5的表达及与131Ⅰ-anti TLR5 mAb在移植皮肤部位摄取的相关性分析将注射131Ⅰ-anti TLR5 mAb的72 h两组行放射性磷屏自显影小鼠脱椎处死,完整取下其移植皮肤及受体移植床部分组织,福尔马林固定并制成石蜡切片,进行TLR5染色。分析TLR5表达与该移植皮片摄取131Ⅰ-anti TLR5 mAb的相关性。研究结果1、131Ⅰ-anti-TLR5 mAb标记率为96.9%,比活度为458.6 MBq/mg,并且有良好的免疫学活性,Kd值为3.672 nM,最大结合量Bmax为5.388μM,半抑制浓度(IC50)和抑制常数(Ki)分别为8.89 nM和40.38 nM。131Ⅰ-anti-TLR5 mAb体外放置72 h,放射化学纯度大于90%。2、体内生物学分布结果显示,雷帕霉素治疗组,注射131Ⅰ-anti-TLR5 mAb 1 h移植皮肤的%ID/g值达到最大值,为12.05±1.86,注射后72 h, T/NT值达到最大,为8.10±0.10；而131Ⅰ-anti-TLR5 mAb虽然也在排斥对照组移植部位聚集,但是明显低于耐受组(p<0.001)。TLR5阻断组全身组织器官放射性比活度明显降低,移植皮片部位%ID/g降低92%,表明移植部位的131Ⅰ-anti-TLR5 mAb摄取是特异性的。3、动态全身放射性自显影图像的结果与体内生物学分布相一致,显示在注射12h后,’31Ⅰ-anti-TLR5 mAb在雷帕霉素耐受组移植物部位明显浓聚且明显高于对照组,在72 h获得移植皮肤对比度最为清晰显像。移植部位放射性活度分别为26,448±904 DLU/mm2(雷帕霉素治疗组),9176 ± 576 DLU/mm2(移植排斥组)和3881.5±62.6 DLU/mm2(阻断组)(p<0.05)。TLR5阻断组移植皮肤放射性浓聚图像几乎不可见。4,131Ⅰ-anti-TLR5 mAb在两组实验小鼠移植物皮肤部位的摄取与同一组织TLR5的表达呈明显正相关(r2=0.93,P<0.0001)。第二部分131Ⅰ-anti TLR5 mAb/131Ⅰ-IgG/18F-FDG在雷帕霉素治疗的同种移植模型中显像价值的评价研究方法1、建立小鼠同种移植模型以C57BL/6小鼠为供体,将其背部全厚度皮肤移植到受体BALB/c小鼠,建立同种移植排斥模型。将模型小鼠分为对照组和雷帕霉素治疗组；治疗组在移植术后每日腹腔注射雷帕霉素1.5 mg/Kg,直至对照组小鼠移植皮肤完全排斥,对照组术后每日腹腔注射等量的PBS。2、131I标记的放射性示踪剂的制备和生物学活性检测131 Ⅰ-anti TLR5 mAb制备及鉴定方法同第一部分；Iogogen法制备并纯化对照同种型示踪剂131 Ⅰ-IgG。分别将131 Ⅰ-IgG放入小鼠血清和生理盐水中,37℃水浴,0h,12 h,24h,48 h,72 h和96 h分别检测标记物体外稳定性。3,131Ⅰ-anti TLR5 mAb,131Ⅰ-IgG和18F-FDG在同种移植模型动态分子显像中的对比研究在移植术后第7天分别向两组实验小鼠通过尾静脉分别注射131Ⅰ-anti TLR5mAb和131Ⅰ-IgG (0.37 MBq/150μ1只),在注射后1 h,12 h,24 h,48 h和72 h进行放射性自显影显像。在移植术后第10天选取两组实验小鼠腹腔注射18F-FDG (5.55 MBq),在注射后30 min,60 min和90 min的时间进行放射性自显影显像。OptiQuantTM图像分析软件检测131Ⅰ-anti TLR5 mAb,131Ⅰ-IgG与18F-FDG在移植皮肤部位的浓聚状况并进行对比分析。研究结果1、131Ⅰ-IgG标记率为96.2%,比活度为407.2 MBq/mg,在小鼠血清和生理盐水中测定的体外稳定性在72 h后均高于90%。2、在注射131Ⅰ-IgG 12h后显示其在雷帕霉素治疗组移植皮肤部位出现浓聚,但是其放射性活度明显低于131Ⅰ-anti TLR5 mAb,表明131Ⅰ-anti TLR5 mAb在移植皮肤部位浓聚是标记物与TLR5受体特异性结合的结果,而非同种型IgG Fc段的非特异性结合所致。3、18F-FDG的高摄取图像仅出现在对照组,而雷帕霉素治疗组移植物对18F-FDG的摄取量很低,图像上几乎不可见。31Ⅰ-anti-TLR5 mAb则在雷帕霉素治疗组持续高摄取。131Ⅰ-anti-TLR5 mAb与18F-FDG最高T/NT比值分别为(7.68和1.16)(p<0.001)。这表明131Ⅰ-anti-TLR5 mAb对雷帕霉素应用后的移植物分子影像检测与非特异性显像剂相比有明显的优势。第三部分同种移植排斥过程中自噬分子的表达及意义研究方法1、建立小鼠同种移植模型和雷帕霉素治疗组模型方法见第一部分。2、自噬水平以及自噬发生相关基因和蛋白在移植模型尽力过程中的表达变化在小鼠同种移植模型术后的第4天,第8天,第12天和第16天,脱椎处死小鼠,分别取移植皮肤和脾,提取总mRNA和总蛋白。利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测移植皮肤和脾细胞中自噬相关基因Beclinl,ATG5的转录表达水平。Western blot技术检测移植皮肤和脾细胞中自噬相关蛋白Belcinl,ATG5和LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ表达检测自噬发生水平。3、同种移植小鼠移植皮肤部位131 Ⅰ-anti-TLR5 mAb摄取与自噬发生水平的相关性分析以同种移植排斥组和雷帕霉素治疗组小鼠移植皮肤部位免疫组织化学TLR5染色测得的TLR5表达量与相应自噬的水平做相关性分析。研究结果1、实时荧光定量PCR结果显示在同种排斥组中,自噬相关基因Becln1和ATG5均从移植术后第8天起升高,在第12天达到高峰,在第16天下降。在雷帕霉素治疗组出现同样的趋势,从第8天起的表达明显高于同种移植组。而且两组移植皮肤部位的表达均明显高于脾细胞(p<0.01)。2.Western blOt结果显示Beclin1和ATG5蛋白表达与其基因表达水平一致：Becln1和ATG5均从移植术后第8天起升高,第12天达到高峰,第16天下降。在同种移植组,自噬相关分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(自噬发生水平)在雷帕霉素治疗组最高,而且在同种移植急性排斥反应较强时明显升高,在同种移植急性排斥反应减弱后随之降低(p<0.01),表明自噬与移植排斥反应呈明显相关。更重要的是我们发现自噬相关基因与蛋白的变化在移植皮肤部位的变化比在脾脏的变化更加显著。3、自噬分子与TLR5表达相关性分析：同种移植排斥模型中,移植皮肤部位自噬发生水平与TLR5的表达成正相关(r2=0.79)。全文结论1.制备了131Ⅰ-anti-TLR5 mAb,经鉴定具有良好的特异性和生物学活性2.体内生物学分布结果显示,在同种移植模型中,131Ⅰ-anti-TLR5 mAb被移植皮肤部位高摄取,显著高于对侧正常皮肤；与同种移植模型相比,雷帕霉素治疗后移植皮肤部位对131Ⅰ-anti-TLR5 mAb的摄取的T/NT值更高。全身磷屏放射自显影结果与体内生物学分布结果一致,在雷帕霉素应用后,131Ⅰ-anti-TLR5 mAb对移植物清晰显像。3. Anti-TLR5 mAb可显著阻断131Ⅰ-anti-TLR5 mAb在移植皮肤部位的浓聚,证明131Ⅰ-anti-TLR5 mAb在移植皮肤部位的特异性摄取,而不是非特异性的聚集。4.同种移植皮肤部位对131Ⅰ-anti-TLR5 mAb的特异性摄取与该部位TLR5的表达成明显正相关。5.与同种型对照抗体131Ⅰ-IgG和非特异性显像剂18F-FDG影像学研究进行比较,131Ⅰ-anti-TLR5 mAb在雷帕霉素治疗后的移植物有更高的T/NT值,具有明显的影像学显像优势和特异性。6.通过实时定量PCR和Western blot技术研究发现在同种移植模型中,自噬的相关基因、蛋白和发生水平与移植排斥反应密切相关,雷帕霉素的应用在调节移植排斥反应的同时也引起自噬水平发生相应改变。7.同种移植排斥过程中TLR5的表达和自噬的水平变化与移植排斥反应成显著相关,可能是参与同种移植排斥的免疫调节的新机制。