甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对细胞DNA损伤和凋亡的诱导作用机制研究

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甲维盐是以阿维菌素B1为源基团合成的新型大环内酯类杀虫剂,对鸟类、蜜蜂、水生动物类具有较高的安全性,对鳞翅目害虫具有高效的控制潜能。研究表明,甲维盐对昆虫GABA受体有激动作用,促进GABA与神经末梢膜或细胞器膜高效结合,导致氯离子通道开放和细胞膜对氯离子的通透性增加,从而抑制害虫神经传导,导致害虫麻痹死亡。甲维盐对哺乳动物无致癌、致畸、致突变性或神经毒性。目前,甲维盐的具体作用机制仍尚未明确,但随着甲维盐在害虫防治中的广泛应用,其对非靶标生物的环境安全性和遗传毒性深受人们的关注。本论文以人HeLa细胞和昆虫Tn581-4、Sf9细胞为研究对象,拟研究甲维盐对细胞DNA损伤和凋亡的诱导作用,初步探明甲维盐潜在的遗传毒性,为甲维盐的合理安全使用和作用机理研究提供实验基础。  MTT法研究表明,甲维盐对HeLa、Tn581-4、Sf9等细胞活力均有显著的抑制作用,且该抑制作用与甲维盐的作用时间和作用剂量相关;与Tn581-4和Sf9细胞相比,HeLa细胞对甲维盐的毒性作用更敏感。  彗星电泳实验表明,甲维盐可诱导HeLa、Sf9、Tn581-4细胞出现明显的彗星拖尾,且随药物浓度的升高和作用时间的延长,彗星尾长、尾面积和彗星细胞数都逐渐增加。免疫荧光研究表明,细胞中γH2AX焦点数和阳性细胞数都与甲维盐浓度和作用时间呈正相关,且甲维盐可诱导细胞形成大小不同的焦点。  AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术和AO-EB双染表明,甲维盐可诱导HeLa和Sf9细胞发生早期凋亡或晚期凋亡,凋亡细胞的比例均随着甲维盐浓度的增加呈增大。DAPI核染结果表明,凋亡细胞的细胞核出现形状不规则、核固缩、染色质凝聚和染色质片段化等现象。  细胞内ROS水平检测和Western blot表明,甲维盐可引起细胞内ROS水平升高,并且ROS水平的升高与甲维盐的浓度及作用时间有关。但甲维盐对caspases级联反应中凋亡蛋白caspase-3表达的影响不显著。  研究表明,甲维盐能显著抑制HeLa、Tn581-4、Sf9等细胞活力,引起细胞单链DNA和双链DNA损伤、细胞核固缩形变、染色质凝聚或片段化等现象,诱导细胞发生早期凋亡或晚期凋亡,同时表明,甲维盐的细胞毒性可能与其引起细胞内ROS水平升高有关。
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