研究背景和目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。在我国占全身各种恶性肿瘤的7%-10%。近年来在我国,特别是在一些大城市及沿海经济发展较快的地区,发病率呈迅速上升趋势,是危害妇女健康的主要疾病。回首过去的二十年,乳腺癌的诊治取得了长足的进展,尤其是在外科治疗方面的发展取得了较好的效果。与此同时,对乳腺癌生物学行为的认识也不断深入,利用现代分子生物学技术对肿瘤的发生、发展进行了进一步的阐述,针对乳腺癌的预后,尤其是已发生侵袭转移的晚期患者预后较差,侵袭转移机制亦已成为当今的研究热点。众所周知,恶性肿瘤的侵袭转移是个多因素、多步骤的进展过程,但其具体机制仍不清楚。全世界每年约有120万妇女患上乳腺癌,占所有女性肿瘤的18%,其中超过17万的患者是三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC),占乳腺癌患者的10%-23.8%。TNBC具有侵袭性强、复发早、进展快、生存时间短等特殊临床生物学行为,且对大多数内分泌治疗及乳腺癌的靶向治疗(针对HER-2过表达和雌孕激素受体表达阳性)不敏感,预后较其他类型乳腺癌差。传统的肿瘤治疗模式(手术、放疗、化疗)依然是目前肿瘤治疗的主要手段。然而,随着对肿瘤细胞生长、增殖、凋亡的分子机制研究的深人,伴随着分子生物学革命性的进展,肿瘤的治疗已进人生物治疗时代,使人类靶向性治疗肿瘤成为可能。靶向治疗用肿瘤细胞可以表达,而正常细胞很少或不表达的特定基因或基因的表达产物,形成相对或绝对靶向,最大限度地杀伤肿瘤细胞,而对正常细胞损伤很小的治疗方法。乳腺癌分子靶向治疗是指针对乳腺癌发生、发展有关的癌基因及其相关表达产物进行治疗。用于治疗乳腺癌的分子靶向药物通过阻断肿瘤细胞或相关细胞的信号转导,来控制细胞基因表达的改变,而产生抑制或杀死肿瘤细胞。由于三阴乳腺癌组织学分级较差,不表达ER,PR和HER-2,且多伴有p53突变、EGFR的表达,目前较常用的分子靶向药物不针对这个亚型,尽管该亚型对新辅助化疗有较高的总反应率和病理缓解率,但总体预后仍为最差。目前尚无TNBC的治疗指南,其治疗一般按常规治疗标准进行。近年来,许多研究者启动了多个国际、多中心临床研究,认为三阴乳腺癌主要选择紫杉类、铂类、蒽环类及分子靶向治疗药物。目前寻找TNBC的新治疗靶点是当今世界研究的难点和热点。近年有多项研究表明抑制Galectin-3表达可以影响肿瘤细胞的增殖凋亡,鲜有针对乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌的研究。Galectin-3是一种半乳糖苷结合蛋白,属于凝集素家族,它在细胞与细胞间及细胞基质相互作用、细胞生长、细胞周期调控、细胞凋亡、细胞损伤和修复过程,肿瘤转化、转移等过程中扮演了一个重要角色。近年来,几项研究证明了Galectin-3在人类肿瘤中过度表达,包括大细胞淋巴瘤、结直肠癌、乳腺癌、肝癌、脑部肿瘤、黑色素瘤、甲状腺癌。Survivin是一个调亡抑制基因,具有调节细胞增殖和调亡的能力,位于人类染色体17q25,有4个外显子和3个内含子,编码全长1417kb。研究发现Survivin表达在所有常见的人类肿瘤内,从35%的胃癌患者到几乎100%的恶性黑色素瘤患者中均可检测到。在大多数病例中,Survivin的表达预示着较差的预后。,Survivin主要表达于胚胎、发育的胎儿组织和大多数肿瘤组织内,而不表达于成熟的正常组织。Ki-67表达在细胞周期的所有阶段除了Go,它可以用来评估生物行为和增殖活性的细胞。这种过度表达的Ki-67已经被观察到在许多恶性肿瘤。自从1980年代早期被发现以来,Ki-67一直是肿瘤增殖标志物的研究热点,尤其在淋巴瘤、乳腺癌、内分泌和脑癌。它常作为一个补充的分级系统,包括提示增殖信号的有丝分裂计数。Ki-67是Oncotype评分中的五个扩散基因之一,此外还有16个癌症相关基因,共同检测肿瘤复发。本课题首先从半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、生存蛋白(Survivin)、Ki-67的角度研究乳腺癌侵袭转移的机制,以指导临床上的诊断、分类、预后和治疗。本实验接着从RNA干扰的角度探讨经过干扰后Galectin-3与三阴性乳腺癌增殖和凋亡的关系,了解Galectin-3在三阴性乳腺癌中的生物学作用,为其能否作为三阴性乳腺癌的基因诊断和治疗的靶点提供依据。此外,乳腺癌5年生存率约50～60%,近50%患者治疗后复发转移,而晚期乳腺癌患者平均生存时间仅18～30个月。治疗乳腺癌虽然有多种方案可选择,然而预后均不理想,副作用大,且乳腺癌易乳腺外转移,因而成为治疗上最困难的肿瘤之一。传统的治疗方法仅能杀死肿瘤细胞中处于分裂期的细胞,一旦治疗停止,肿瘤干细胞仍会继续增殖和分化,导致肿瘤的复发或转移,这就是“蒲公英”现象。2003年,Al-Hajj等在乳腺癌患者的原发病灶中进行了分子标记,发现具有CD44+/CD24-/Lineage-表型的乳腺癌细胞在免疫缺陷动物模型中具有显著的致瘤能力,其移植瘤的细胞组成与原发灶肿瘤相同,在经过多代细胞培养之后,还具有较强的致瘤性,提示这类细胞具有与乳腺干细胞类似的自我更新和分化的本质,将其称为乳腺癌干细胞。乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells, BCSCs), BCSCs被认为是肿瘤发生、发展与维持的基础,与肿瘤的复发、转移和对治疗的耐受有关。目前研究认为只有少数BCSCs进入细胞周期,而多数BCSCs处于静止状态,故BCSCsRg常规的化疗药物并不敏感。现有的物理、化学药物治疗手段所针对的是大多数的肿瘤细胞,对肿瘤中少数的BCSCs无法达到最有效的杀灭效果,不能防止恶性肿瘤的复发及转移,而肿瘤的复发与转移是患者死亡的主要原因。现有的乳腺癌治疗方法多旨在尽可能杀死或清除一切肿瘤细胞,但是对存在于肿瘤中的数量稀少的干细胞样细胞群却作用甚微,治疗后残存肿瘤干细胞的增殖,足以促使肿瘤复发和转移。乳腺癌干细胞高表达表面标志物ABC蛋白、MDR. ABCG2等,但是目前尚未找到特异性的靶向治疗标志物。目前,乳腺癌干细胞的靶向治疗研究主要有：(1)DNA损伤修复阻断剂,如ADP核糖聚合酶1(PARPI)阻断剂；(2)细胞表面受体,如EGFR、C-Kit;(3)血管表皮生长因子受体vascular endothelial growth factor(VEGF) receptor抑制剂；(4)Src激酶抑制剂；(5)哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白mammalian target of rapamycin(roTOR);(6)白细胞介素IL；(7)肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand(TRAIL)等。人类黑色素瘤分化相关基因-7/白介素-24(Melanoma diffrentiation-associated gene-7/interleukin-24, MDA-7/IL-24)是一个新型的、具有细胞因子样特性的肿瘤抑制基因,是IL-10细胞因子家族的新成员。它编码分泌型蛋白产物(secreted MDA-7/IL-24protein, sMDA-7/IL-24),与免疫系统的白介素功能相同,并具有抑制肿瘤生长及特异性诱导肿瘤细胞凋亡的能力。目前的实验研究表明IL-24在抑制和分化肿瘤细胞,促进肿瘤细胞凋亡；同时抑制肿瘤周围血管形成；增强肿瘤细胞对放疗、化疗的敏感性；抑制肿瘤细胞的侵袭和转移等方面具有重要作用。IL-24具有多效性、选择性、重叠性、协同性、拮抗性和网络性双重性作用特点。但在研究中发现IL-24并不能完全消灭种植在裸鼠身上的肿瘤。解决这一问题的方法有二种：(1)与其他细胞因子联合；(2)使细胞因子可以稳定高效地表达作用在肿瘤部位。有报道指IL-24能诱导并增强肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(Tumor Necrosis Factor-related related apoptosis inducing ligand, TRAIL)的活性。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-Related Apoptosis Inducing Ligand, TRAIL)或称凋亡素2配体(Apo-2ligand, Apo2L)是由Wiley等从人心肌cDNA文库中克隆出来的,因其氨基酸顺序具有TNF超家族的结构特征并能诱导Jurkat细胞和EB病毒转化的人类淋巴细胞凋亡而得名,因其能诱导不同来源的肿瘤细胞以及病毒转化的细胞发生凋亡,而对正常组织细胞不具有毒性,不会导致正常细胞发生凋亡,同时与其它抗肿瘤药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞,所以成为肿瘤治疗领域的研究热点,是一种新型的抗肿瘤药物。目前的研究认为TRAIL主要通过位于细胞膜的死亡受体DR4和DR5通过其胞外区与TRAIL结合后活化,其胞内死亡功能域DD传导凋亡信号,活化了细胞内的FADD-caspase途径,激活线粒体非依赖性和线粒体依赖性二种途径介导凋亡的发生。本课题最后拟重组构建IL-24-TRAIL的基因载体,尝试解决细胞因子在治疗乳腺癌干细胞中存在的疗效差、副作用大以及安全性不保障等方面的缺点,为乳腺癌干细胞的基因治疗提供新的实验和理论依据,使广大的乳腺癌患者尤其三阴耐药乳腺癌因本项目而受益。本项研究具有潜在的巨大社会效益和经济效益。方法1. Galectin-3在乳腺癌组织中的表达及与Survivin、Ki-67的相关性1.1采用免疫组化SP法检测120例乳腺癌组织,120例癌旁乳腺正常组织中Galectin-3、Survivin、Ki-67的表达。1.2比较Galectin-3、Survivin和Ki-67表达水平与乳腺癌临床病理特征的关系。1.3Spearman秩检验分析乳腺癌中Galectin-3和Survivin表达的相关性。1.4Spearman秩检验分析乳腺癌中Galectin-3和Ki-67表达的相关性。1.5Spearman秩检验分析乳腺癌中Survivin和Ki-67表达的相关性。2.RNA干扰技术抑制Galectin-3表达对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、凋亡和侵袭的影响2.1设计并化学合成Galectin-3小干扰片段并瞬时转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231(为Galectin-3siRNA组)。2.2以未转染细胞为空白对照,以转染无关siRNA为阴性对照,荧光倒置显微镜观察感染效率,实时定量PCR检测干扰结果。2.3XTT方法观察干扰后24,48,72和96h各组细胞增殖吸光度(A值),流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。2.4划痕实验和Transwell实验比较不同组间细胞迁移和侵袭情况。3. IL-24-TRAIL基因载体的构建及其对乳腺癌干细胞迁移和凋亡的影响3.1以人胎盘组织总RNA为模板,采用RT-PCR二步法,扩增TRAIL的cDNA序列,将其克隆入pIRES载体。3.2扩增IL-24的cDNA序列,将其克隆入pIRES-TRAIL载体,构建其真核瞬时表达载体pIRES-IL-24-TRAIL。3.3以Lipofectamine2000转染技术,将TRAIL、IL-24基因导入乳腺癌干细胞MCF-7和MDA-MB-231。3.4流式细胞仪检测两组细胞凋亡情况。3.5划痕实验比较不同组间细胞迁移情况。4.统计分析均采用SPSS13.0统计学软件包分析和处理实验结果数据,采用Chi-square test分析Galectin-3、Survivin、Ki-67蛋白表达与临床病理资料(包括病人年龄、性别、肿瘤分级及TNM分期)之间的联系。用Pearson列联系数(C)和配对资料的卡方检验,进一步分析Galectin-3、Survivin、Ki-67蛋白三者的相关性。细胞实验数据均以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA):进行方差齐性检验,各组间反应变量为方差齐性,则组间比较采用LSD法,若方差不齐采用近似方差分析Brown-Forsythe法进行校正,采用析因分析明确分组与时间点之间是否存在交互作用,以P<0.05确定为差异具有显著性,双侧检验。结果1. Galectin-3在乳腺癌组织中的表达及与Survivin、Ki-67的相关性1.1120例乳腺癌组织中Galectin-3和Ki-67在乳腺癌组织中表达高于癌旁正常组织(75.00%VS8.33%,χ2=109.70,P＜0.001；62.50%VS6.67%,χ2=82.68,P<0.001),并与乳腺癌病理分级、腋窝淋巴结转移有关(χ2=8.571,P=0.014；χ2=4.444,P=0.035；χ2=6.834,P=0.033；χ2=18.809,P<0.001),差异具有统计学意义,但与年龄、肿瘤大小无显著相关(χ2=0.012,P=0.913；χ2=0.212,P=0.645；χ2=0.192,P=0.661；χ2=0.042,P=0.837)。1.2Survivin蛋白的阳性表达率为70.83%,显著高于癌旁正常组织5.00%(χ2=110.50,P＜0.001),且与淋巴结转移有关(χ2=9.076,P＜0.001),差异具有统计学意义,但与年龄、肿瘤大小,肿瘤组织分级均无显著相关性(χ2=0.003,P=0.959；χ2=0.156,P=0.925；χ2=0.048,P=0.827)。1.3乳腺癌组织中Galectin-3、Survivin和Ki-67三者间两两呈正相关(χ2=24.27,C=0.41,P＜0.001；χ2=27.23,C=0.43,P＜0.001；χ2=26.18,C=0.42,P＜0.001)。2.RNA干扰技术抑制Galectin-3表达对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、凋亡和侵袭的影响2.1转染后24h,荧光倒置显微镜显示转染效率为80.60±5.62%,实时定量PCR提示Galectin-3siRNA转染后相应Galectin-3的表达显著下降(0.077±0.003VS0.072±0.004VS0.016±0.001,F=479.7,P<0.001)。2.2干扰后24,48,72和96h空白组和阴性对照组细胞继续生长,Galectin-3siRNA组细胞生长抑制,数量逐渐减少(1.61±0.05、1.86±0.04、2.04±0.26、2.80±0.07VS1.60±0.07、1.77±0.10、2.01±0.37、2.49±0.15VS1.18±0.04、0.97±0.02、0.68±0.15、0.46±0.12),干扰时间和实验分组之间存在交互效应(F=39.18,P＜0.001)。2.3流式细胞术分析发现,Galectin-3siRNA组比空白对照组、阴性对照组凋亡率高(36.99%±0.27%VS2.22%±0.03%VS3.84%±0.05%),差异有统计学意义(F=44058.82,P＜0.001)。2.4Transwell侵袭实验显示转染Galectin-3siRNA的乳腺癌细胞浸润穿过Matrigel膜的细胞数比空白对照组和阴性对照组的细胞数(154.70±24.01VS465.00±31.76VS322.30±23.18),差异有统计学意义(F=102.30,P<0.001)。细胞划痕实验显示Galectin-3siRNA组细胞迁移能力显著低于空白对照组和阴性对照组(愈合率：48.39%±1.63%VS92.62%±2.88%VS88.49±2.25%,F=308.80,P<0.001)。3. IL-24-TRAIL基因载体的构建及其对乳腺癌干细胞迁移和凋亡的影响3.1克隆到TRAIL、IL-24基因的cDNA序列,成功构建其真核表达载体。3.2流式细胞仪发现,MDA-MB-231细胞组结果显示转染组比空白对照组、阴性对照组凋亡坏死率高,差异有统计学意义(27.91%±1.05%,68.81%±5.53%VS10.54%±1.13%,9.52%±0.95%,F=272.90,P<0.001)。MCF-7细胞组结果显示转染组比空白对照组、阴性对照组凋亡坏死率高,差异有统计学意义(13.69%±1.09%,58.71%±3.03%VS3.31%±0.22%,4.32%±0.47%,F=774.60,P<0.001)。3.3分别对MDA-MB-231、MCF-7细胞进行划痕实验,结果发现48h后空白对照组和阴性对照组细胞运动迁移基本上覆盖了大部分划痕区(愈合率：91.77%±2.25%、87.54%±2.93%；93.34%±2.33%、89.54%±2.15%),而转染组划痕区依然显著存在(愈合率：37.47%±1.53%、30.21%±1.29%；39.8%±1.22%、31.85%±1.33%),表明细胞迁移能力下调(F=716.40,P＜0.001；F=848.10,P＜0.001)。结论1. Galectin-3在乳腺癌组织中的表达及与Survivin、Ki-67的相关性Galectin-3、Survivin、Ki-67蛋白相互协同作用,通过抑制细胞凋亡,对乳腺癌发生和发展起重要作用。2.RNA干扰技术抑制Galectin-3表达对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、凋亡和侵袭的影响RNA干扰能抑制Galectin-3的表达以及MDA-MB-231细胞的增殖,并诱导细胞凋亡、降低其迁移侵袭能力。3. IL-24-TRAIL基因载体的构建及其对乳腺癌干细胞迁移和凋亡的影响pIRES-IL-24-TRAIL构建成功,并能诱导乳腺癌干细胞凋亡、降低其迁移能力。创新之处1.乳腺癌的发生发展涉及多个基因及各种调控因子的相互作用,是一个复杂的过程,Galectin-3、Survivin及Ki-67与乳腺癌的预后有显著的相关性,可作为乳腺癌的预后指标,有待进一步研究探讨三者具体的作用机制,为乳腺癌靶向治疗提供了新的靶点。2.乳腺癌的侵袭转移是一个多因素、多步骤的进展过程,本项目从临床、分子细胞学两方面研究乳腺癌侵袭转移的机制,用RNA干扰技术、免疫组化、RT-PCR、凋亡分析等技术进行研究,很有深度和广度,目前国内外有许多关于Galectin-3siRNA在呼吸、消化道等肿瘤治疗上的研究,但少有关于三阴性乳腺癌的研究,本课题具有重大应用价值和理论意义。3.虽然国际上已经开始利用重组IL-24或TRAIL治疗某些恶性肿瘤的实验研究,但是尚未有联合在乳腺癌方面运用的报道,本研究项目拟采用pIRES作为IL-24和TRAIL基因的载体,构建pIRES-IL-24-TRAIL,使其在肿瘤内长时间表达具有生物学活性的IL-24和TRAIL,以提高肿瘤治疗效果,而且因为其具有人源化、分子量小、穿透力强、免疫原性弱和易于大规模制备的特点,在发挥生物导弹强大威力的同时达到较理想的安全性。通过文献检索,目前尚无类似报道。此药物能成功上市将会为广大乳腺癌患者带来福音,具有极大的经济及社会效益。